世界初、糖鎖の変化を測定して肝臓の線維化進行度を判定

NEDOは、｢複合糖質生産利用技術｣を1991年度から10年間、｢機能性糖鎖複合材料創製技術開発｣を1999年度から5年間実施しました。さらに糖鎖研究の基礎を強固にして将来の一層の成長を期するため、2000年度（補正）〜2003年度まで「糖鎖合成関連遺伝子ライブラリーの構築」、2002年度（補正）〜2005年度まで「糖鎖構造解析技術開発」、2006年度から2010年度まで「糖鎖機能活用技術開発」を実施しました。これらのプロジェクトの主力を担った産総研は、糖鎖合成・糖鎖構造解析・糖鎖機能解明の技術基盤開発を行うとともに、糖鎖の特定構造に反応するレクチン（糖鎖に結合するタンパク質）を用いた糖鎖解析技術を開発したことで、産業化に結びつくバイオマーカー開発の基盤技術を確立しました。さらに、肝線維化の進行に伴う微細な糖鎖構造の変化を見い出しています〈図1〉。

図1 疾患の進行に伴って糖鎖構造の変化する糖タンパク質のモデル図（提供：産業技術総合研究所）

今回、製品化された「HISCL M2BPGi」試薬では、肝細胞から分泌されるM2BPというタンパク質が使われています。M2BPは、肝細胞をはじめとして多くの細胞から分泌されており、糖鎖の修飾を多く受けるという特徴を持っています。一つのM2BPには7本の糖鎖が付いていますが、通常は血液中で10〜16個のM2BPが重合し、ドーナツ状の多量体を作っています〈図2〉。ドーナツ状なので球体よりも表面積が大きく、多量体表面の糖鎖の量は70〜120本になります。肝臓由来のM2BPは、肝線維化の進行に伴いタンパク質は変化せずに糖鎖構造が変化します。この変化した糖鎖部分に特異的に結合するレクチンを用いて測定することで、迅速で高感度に異常を検出できることになります。M2BPを使う理由としては、血液中で多量体となるため糖鎖の数が多く、レクチンとの結合が強くなるためです。

図2 M2BP単量体と多量体（提供：産業技術総合研究所、シスメックス株式会社）

産総研が、肝線維化糖鎖マーカーの基本的な技術開発をしている段階での分析時間は18時間でした。糖鎖−レクチンの結合は緩やかで弱いため、それだけの時間が必要だったのです。しかし、18時間では実用化レベルとはいえません。そこで産総研は、臨床検査装置・試薬メーカーであるシスメックス社と協力して、患者さんが来院している間程度の短時間で測定可能な、いわば実用化できる肝線維化糖鎖マーカーの開発を行いました。そこで選択されたのが、糖鎖の数が多く、レクチンとの結合が強い特徴をもつM2BPであり、これを使用することによって、シスメックスの全自動免疫測定装置「HISCL」シリーズでの短時間測定が可能な「HISCL M2BPGi」試薬が完成しました。

HISCL M2BPGi試薬はR1、R2、R3の3液構成で、R1試薬とR3試薬は一体型の容器で提供される。（左：一体型容器、右：R2試薬容器）（提供：シスメックス株式会社）

17分という短時間で精度の高い測定が可能

シスメックス社は、「糖鎖機能活用技術開発」（2006〜2010年度）に、2009年8月から参加しています。参加した経緯についてシスメックス株式会社ICHビジネスユニット免疫・生化学プロダクトエンジニアリング本部長の高浜洋一さんは次のように語っています。
「当社は、これまでにもウイルス性肝炎の感染症マーカーを数多く開発・販売しているため、肝臓疾患に関するバイオマーカーには関心がありました。2009年の初めごろに、NEDOプロジェクトの存在を知り、プロジェクトリーダーである産総研糖鎖医工学研究センターの成松久センター長（当時）から肝臓関係のバイオマーカーの開発を実施していることをお聞きし、NEDOプロジェクトの公募に応募しました。結果、実用化の担当企業として途中からではありましたがプロジェクトに参加させていただきました。我々への要請は短時間での測定を可能にすること。当社の試薬はすべて当社の装置である『HISCL』に乗せており、ここでの測定時間はすべて17分です。肝線維化糖鎖マーカーも17分での測定を可能にしようと、かなりの試行錯誤を行いました」。

免疫血清検査に使用される全自動免疫測定装置HISCL-5000。感染症や腫瘍マーカーなどのさまざまな試薬の測定を約17分という短時間で行うことができる。（提供: シスメックス株式会社）

シスメックス社では、自社の全自動免疫測定装置「HISCL」や各種の試薬の開発の経験から、装置開発・試薬開発において蓄積した技術を持っていました。しかし、レクチンを使った測定系は初めてで、戸惑うことも多かったといいます。糖鎖−レクチンの結合は緩やかで弱いという欠点がありますが、装置の中で全自動測定を行うためには、装置内でかなり過酷な条件を課す必要があります。試薬自体を修正するのか、それとも装置内のフローを変えるのか。産総研とも熱心な議論が交わされ、最終的には装置と試薬の両方の開発スタッフを持つ強みを活かし、17分での測定を可能にしました。

HISCL-5000にセットされた試薬。R1～R3試薬を同時に24セット架設できる。

「HISCL M2BPGi」試薬が完成したあとは、臨床での実証が待っています。この実証は、産総研に「HISCL」を設置し、産総研が中心となって行いました。実際の血液サンプルを使って、精度よく検査結果が出るかを確かめなければなりませんが、ここで苦労したのがしっかりした検体の確保です。その血液がどのような状態（肝線維化のレベル）にあるのかがはっきりとわかるものを数多く集めなければ、検査結果を検証できません。これについては、肝炎研究で著名な溝上雅史先生（現国立国際医療研究センター肝炎・免疫研究センター長）や厚生労働省の肝炎研究班の協力のもとに約6000検体を集め、検証を行いました。その結果、生体組織診断の結果と良い相関関係を示し、慢性肝炎の初期（F0）から肝硬変（F4）まで至る肝炎の各ステージ間でも連続的に肝線維化状態を示すことができました〈図3〉。臨床的に非常に良い結果を得ることができ、医師や大学の先生からも高い評価を得ています。

図3 肝臓の線維化ステージと測定結果（C.O.I）との関係（提供：シスメックス株式会社）

糖鎖の機能活用技術開発から肝線維化糖鎖マーカーという製品が生まれたことで、今後は糖鎖機能活用の技術開発に拍車がかかって来ると思われます。今後の新たな糖鎖マーカーの可能性について、成松さんは次のように語っています。
「糖鎖によるバイオマーカーは、慢性の変性疾患のほとんどに利用できると思います。ただ、血液を使うのが最適かどうかはわかりません。基本的な考え方は、構造変化した糖鎖分子が最も濃縮された体液を使うということです。唾液の場合もあるでしょうし、尿の場合もあるでしょう。どれが最適かを研究していけば、糖鎖によるバイオマーカーの可能性は大いに広がっていくと思います。すでに、胆管がんに対して胆汁内の糖鎖マーカーを測定して診断する技術開発を行い、論文発表を行っています。糖鎖研究に関して、NEDOは先見の明があり、日本はこれまで最も進んでいましたが、ここにきてアジアやアメリカに追いつかれつつあります。各国ともに大きな予算を掛けて技術開発を行ってきています。これまでの技術優位性を生かし、さらに糖鎖研究を進めていきたいと考えています」。（2015年2月 取材）

すでに全国を3周以上しているというHISCLカー。全自動免疫測定装置HISCLを荷台に設置し、全国各地の医療機関等に出向いて実際に測定を行うことで、検査担当者に実体験してもらっている。（提供：シスメックス株式会社）