成果報告書詳細
管理番号20110000000147
タイトル平成20年度~平成21年度成果報告書 分子イメージング機器研究開発プロジェクト 新規悪性腫瘍分子プローブの基盤技術開発 「分子プローブ要素技術の開発」
公開日2011/5/3
報告書年度2008 - 2009
委託先名財団法人神奈川科学技術アカデミー
プロジェクト番号P08029
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約 (3)-2
 第一にシグナルユニットの高分子ミセル内核への封入を行った。まず、基準となるインドシアニングリーン(ICG)を薬物キャリヤー用に開発した高分子ミセルへ物理的に封入を行ったところ、50%以上の高い収率で、最大7.6wt.%のICG含有量の高分子ミセルが得られた。手順が複雑で体内での毒性の懸念からは好ましくない化学結合法を用いることなく、簡便で体内での使用を考慮すると好ましい物理封入法によって収率と含有量について十分な値を得た。ミセル内に物理的に封入されたICGの蛍光強度は、freeのICGの70%程度の強度であり、ICG蛍光消光現象は、あまり大きくなく、目標とした40%を上回る結果であった。この結果を受けて、次に東京大学長野研究室が合成した新規プローブユニットであるSiR700の高分子ミセルへの封入を検討した。SiR700封入の収率はICGに比べると低く、ミセル内の含量が0.8wt%のものを得た。SiR700は蛍光強度が強いことを考慮すればこの含量でも満足ゆくものである。また、物理的に封入したSiR700の蛍光強度もfreeのSiR700の50%以上の強度を示し、蛍光消光もそれほど大きくなく、目標値をクリアしている。 認識ユニットの高分子ミセルへの結合に関しては、当初、中間目標として標的ユニットのモデル化合物であるRGDSペプチドを用い、高分子ミセルとの結合反応条件を最適化した上で、本プロジェクトで新規に得られる標的ユニット(抗体)を結合させる計画であった。しかし、本プロジェクトの共同委託先である東京慈恵会医科大学大川清教授から、抗CD147抗体を結合反応条件検討のために必要な充分量を供給されることとなった。その結果、中間目標としてのモデル化合物RGDSペプチドを省略して、抗CD147抗体で結合反応条件検討を行うこととなった。高分子ミセルの片末端のアセタール基を塩酸処理してアルデヒド基に変換し、これと抗体のリシン側鎖の1級アミノ基とシッフベースを形成させて結合させた。反応のpHと濃度を検討したところ、pH=6.5で、抗CD147抗体濃度22.5μg/mLで、8時間の反応でほぼすべての抗体がミセルに結合することがわかった。次に、CD147陽性のA431細胞抽出液のタンパクを電気泳動によって分画し、ICG封入高分子ミセルを接触させて、ALP標識抗マウス抗体で染色して、抗体による認識・結合を観察した。抗体の結合反応を22.5μg/mLで行った高分子ミセルでは、CD147に限らずに、非特異的に多くのタンパク質に結合していることがわかった。抗体分子1つあたり複数のアミノ基が反応することで、抗体分子間で架橋反応が進行し、そのことで抗体分子の変性が重度に起こったためと考えられる。そこで、抗体結合を3.0μg/mLに低くして高分子ミセルとの結合反応を行った場合は、CD147のバンドに対する特異的な抗体の結合が観察された。この特異的抗体の結合バンド強度はintactな抗CD147抗体に比べると低いものであったが、十分な特異性と結合能を有したものであることがわかった。次に、SiR700封入高分子ミセルについても同様の解析を行った。この場合も、抗体特異的なタンパクへの結合が観察された。物理化学的に異なる性質のシグナルプローブを封入しても、それが内核に封入されるために、ミセル外殻に結合する抗体の結合能には影響しないといえる。これは高分子ミセルが有する構造的な特長が、分子プローブシステムでも達成されたことを意味する。
英文要約Title: Developments of novel molecular probe systems using polymeric micelle carriers (FY2008-FY2009) Final Report
 (3)-2
(1) Incorporation of signal units into polymeric micelle inner cores At first, the physical incorporation of ICG was examined. ICG was found to be incorporated through the physical entrapment method in high yields and high ICG contents in the micelle; over 50 % yields and the maximum 7.6 wt.% of ICG in the micelle. This success is very meaningful because the physical entrapment method is more preferable than the chemical conjugation method in terms of the easiness of incorporation and the in vivo toxicity concerns. Fluorescence intensity of the incorporated ICG was high such as 70 % of the free ICG. This value was higher than the aimed value. (49%). A signal unit SiR700, which was synthesized by prof. Nagano of Tokyo University, was also successfully incorporated into the polymeric micelle through the physical method. The fluorescence intensity of the incorporated SiR700 was 50% or more of/than that of free SiR700. (2) Conjugation of specific ligands to polymeric micelles Conjugation of RGDS peptide that was scheduled in the initial plan was omitted because anti-CD147 antibody was supplied by Prof. Okawa of the Jikei Medical University in a large quantity enough for optimization of the conjugation between antibodies and the polymeric micelles. The conjugation was carried out between primary amino groups of the antibody and the aldehyde group at the PEG terminal, which was obtained from the terminal acetal group through hydrolysis with hydrochloric acid. The conjugation of anti-CD147 antibody was revealed to be completed quantitatively at pH 6.5 and at a concentration of 22.5 ~g/mL of antibody for over 8 hours. However, thus obtained antibody-polymeric micelle was revealed to exhibit non-specific binding to cell extracts from CD147-positive A431 cells in a western blot assay. This non-specific binding was considered to result from a high degree of large aggregate formation between the antibody and the polymeric micelle through multiple conjugations. Therefore, the antibody concentration was lowered in the conjugation reaction. The conjugate obtained at the lowered antibody concentration successfully exhibited specific binding to CD147 in the western blot assay. This specific binding behavior was observed both in the ICG-incorporated polymeric micelle and the SiR700-incorporated one. This is a strong advantage of the polymeric micelle carrier systems because the polymeric micelles can exhibit binding functions that are not influenced by the incorporated signal units owing to the phase-separated design (the outer shell and the inner core) of the polymeric micelles.
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