成果報告書詳細
管理番号20110000000142
タイトル平成20年度~平成21年度成果報告書 分子イメージング機器研究開発プロジェクト/新規悪性腫瘍分子プローブの基盤技術開発/分子プローブ要素技術の開発
公開日2011/6/7
報告書年度2008 - 2009
委託先名株式会社キノファーマ 国立大学法人東京医科歯科大学
プロジェクト番号P08029
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約CXCR4はGタンパク質共役型レセプター(GPCR)に属するケモカインレセプターであり、がん細胞の増殖や転移に関与することが知られている。本研究課題ではCXCR4結合リガンドであるFC131を基盤とした多価型リガンドを構築することでがん細胞に対して高い親和性と選択性を有するイメージング分子の開発を目指した。多価型リガンドとして2~4価のFC131を有するリガンドのデザインを試みた。GPCRに対する2価結合型リガンドについてはこれまでにポリエチレングリコール(PEG)や芳香族を含む炭素鎖を用いた例があったがGPCRの構造が明らかでない場合が多いため、的確なデザインが困難であった。そこで比較的強固なへリックス構造を形成することが知られるポリプロリン鎖を用いて二価型結合に必要なリガンド間の距離を求めることにした。ポリプロリン鎖としてL-プロリンを6~27個連結したペプチドを合成した。また、それらの両端にPEGを導入したリンカーも作製した。FC131はシステイン残基を導入し、そのチオール基とリンカー末端に導入したクロロアセチル基の間でコンジュゲートした。ペプチド鎖の合成はFmoc固相合成法を用いて行い、同定はESI-TOFマススペクトルで行った。リンカー長を変化させた2価結合型リガンドについてCXCR4への結合親和性を解析したところ、リンカー長に応じて結合親和性が変化し、ある一定の長さで最大になることが明らかになった。このリンカー長の長さは約5.5~6.5ナノメートルであり、これを基にCXCR4と構造的に相同性の高いロドプシンの結晶構造によってリガンド結合サイトの間の距離を推定した場合の距離(5.3ナノメートル)と同程度であることが明らかになった。このため、ポリプロリンリンカーを有する2価結合型リガンドはCXCR4二分子に対して結合していることが予測された。また、結合親和性の上昇についても一般的な2価結合にみられるような相乗的な上昇であることからも二分子への結合が示唆されている。結合親和性の上昇がみられた2価結合型リガンドのうち18個のプロリンからなるリンカーを有するリガンドについてリンカー部分に蛍光基としてテトラメチルローダミン(TAMRA)を導入して細胞表面CXCR4への結合を共焦点顕微鏡で観察した。細胞にはHeLa細胞を用い、CXCR4はトランスフェクションでプラスミド導入を行い発現させた。この細胞に対してTAMRA標識リガンドを反応させたところ、CXCR4発現細胞では明らかなリガンドの結合が観察された。この結果は、1価型リガンドの結果、およびCXCR4未発現細胞での結果と比較して有意に明確なものであったため、2価結合型とすることで親和性、および選択性が上昇していることが示された。この結果は人工的に強制発現させたCXCR4に対するものであったため、CXCR4を過剰に発現している急性リンパ芽球性白血病由来リンパ球Jurkat細胞についても検討を行った。この結合解析にはTAMRA標識リガンドを用い、解析はフローサイトメーターを用いて行った。Jurkat細胞におけるリガンドの結合に関しても2価結合型リガンドで明らかな結合が見られた。細胞で行った解析においてはリガンド濃度は25nMという低い濃度を用いている。この濃度はこれまでがん細胞のイメージングを目的として用いられている抗体を使用する際の濃度に比べても同程度、あるいはより低い濃度であるため、本研究で作製した2価結合型リガンドはがん細胞のイメージングに用いる結合ユニットとして有効であると考えられる。
英文要約The chemokine receptor CXCR4 is a membrane protein belonging to the family of G protein-coupled receptors (GPCR), which is an attractive drug target. It has been difficult however to obtain structural information pertaining to GPCR which is necessary for drug development. Recent studies have indicated a pivotal role for homo- and hetero-oligomerization of CXCR4 in cancer metastasis and the significance of oligomeric forms of GPCR has been gaining acceptance. However, the functional implications proposed for these oligomers, which include signal transduction and internalization, are poorly understood and require additional study. Interaction of CXCR4 with its endogenous ligand, stromal-cell derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12, induces various physiological functions at the embryonic stage, including chemotaxis, angiogenesis, and neurogenesis, and CXCR4 is relevant to numerous diseases in adulthood. SDF-1 is known to be an agonist of the CXCR4 receptor and its binding induces Ca2+ mobilization. Efforts to understand the correlations have used photochemical analyses such as bioluminescence resonance energy transfer (BRET) analysis but the elucidation of the native state of CXCR4 in living cells is complicated by conformational or functional changes resulting from mutations. Estimates of the precise distance between ligand binding sites in the dimer will permit the development of bivalent ligands of GPCRs with improved binding affinity and specificity. In spite of the enormous efforts in design of bivalent ligands, rational design of such linkers has been difficult because of the lack of knowledge concerning the dimeric form of GPCRs. In this study, we designed and synthesized novel CXCR4 bivalent ligands consisting of two molecules of [cyclo(-D-Tyr-Arg-Arg-Nal-D-Cys-)] (Nal = L-3-(2-naphthyl)alanine) an FC131 analogue, connected by a poly-L-proline or a PEGylated poly-L-proline linker. Poly-L-prolines have been utilized as rigid linkers between the two functional units, which requires predetermined separation for activity. The linkers in this case were expected to maintain a constant distance, from 2 to 8 nm between the ligands. Our bivalent ligands with linkers of various lengths were used to determine the distance between two binding sites of ligands consisting of CXCR4 dimers. Such a “molecular ruler” approach could be utilized in the design of bivalent ligands for any GPCR. Utilizing the specific binding to dimeric form of GPCRs, fluorescent-labeled bivalent ligands have been synthesized as molecular probes and shown to be powerful tools for cancer diagnosis because of their specificity to an expression level of GPCR that depends on pathological conditions of cells. Our approach has the advantages that the ligand can directly capture dimeric forms of GPCRs and the linkers can be applied to virtually any known GPCR receptors. Information from such analysis could offer a consensus to the controversial currently unsolved mechanisms.
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