成果報告書詳細
管理番号20110000000143
タイトル平成20年度~平成21年度成果報告書 新規悪性腫瘍分子プローブの基盤技術開発 分子プローブ要素技術の開発 標的認識ユニットの開発:抗TNC抗体、抗TIF各抗体の安定産生供給と抗体の特異性、力価の評価
公開日2011/6/7
報告書年度2008 - 2009
委託先名株式会社マトリックス細胞研究所
プロジェクト番号P08029
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約標的認識ユニットの開発「抗テネイシンC (TNC)抗体、抗TNC誘導因子(TIF)各抗体の安定産生供給と抗体の特異性、力価の評価」を達成すべく、抗原認識性が高く且つ高力価を持つ抗TNC抗体と抗TIF抗体を開発し、その安定産生供給を目指し研究を遂行した。標的分子としたTNCは細胞外マトリックス分子の一つで、胎生期の組織発生、創傷治癒や炎症ばかりでなく、悪性腫瘍の間質にも強く発現し、浸潤・転移能などに関与する癌間質マーカーである。そこでTNC認識能及び集積特異性の高い抗TNC抗体及び抗TIF抗体を選別してその特性を検討した。まず、ヌードマウス皮下移植腫瘍組織の免疫染色によって、ラット抗ヒトTNC単抗体ライブラリ~から、ヒトTNC特異的な11個の抗体とヒト及びマウスTNC交叉性の4抗体を選別した。慈恵医科大学と共同で、選別抗体の内、特に染色性の高かったRCB1(ヒト特異的)とDEAR1(ヒト・マウス交叉)を蛍光物質(Alexa488, Alexa546)で標識後、免疫染色によって抗原認識能を比較したところ、長波長の蛍光標識の方が、抗原認識能が高いことが分かった。更に、ELISA法で認識能を比較したところ、免疫染色とは異なった力価を示すものも存在した。これより、抗体の修飾や抗原の性状は抗体の力価に影響を及ぼすことが示された。次に、RCB1とヒト・マウス交叉性抗体(DEAR1, DEAR2, 12~2~7, 3~8~9)をIRDye800、Cy5.5、Cy5、Alexa488で標識後、担癌ヌードマウスに投与しin vivo イメージングを行った。IRDye800とCy5.5標識抗体は腫瘍特異的に集積するが、Cy5及びAlexa488標識抗体では腫瘍での蛍光は確認できなかった。また、DEAR1は腫瘍への特異的な集積を示したものの、TNCが存在する関節腱膜にも集積していた。一方、その他の交叉性抗体では、腫瘍以外への集積は見られず、どの抗体も腫瘍特異的に集積していた。更に、東京大学大学院薬学系研究科開発のシグナルユニットSiR700及び市販のCy5.5にて上記各抗体を標識後、同様にin vivo イメージングをしたところ、全ての標識抗体が、非常に高い腫瘍集積能を示した。また、これらの腫瘍の蛍光強度は、96時間をピークとして以後徐々に減弱していくものの、240時間後でも十分に観察可能であった。また、腫瘍と周囲結合織の境界を明瞭に観察できた。そこで、蛍光標識抗体の腫瘍内外での局在を観察するため、凍結切片作製後、無染色で蛍光観察したところ、Sir700及びCy5.5による蛍光は、腫瘍内及び腫瘍辺縁部の間質に観察できた。またFITC標識抗ラットIgG抗体による免疫染色の結果、標識抗体自身が癌間質に留まっていることが明らかとなった。一方、本抗体を、京都大学及び片山化学にて開発中のCy5.5内包リポソームにて標識後、in vivo イメージングを行ったところ、腫瘍への集積と共に、肝臓において強い蛍光が観察された。このことは、シグナルユニットの違いが標識抗体の生体内動態に影響してin vivo イメージングに影響することを示唆している。また、抗TIF抗体の抗原認識能を評価するため、分子間相互作用解析を行った結果、該抗体は、抗原を認識することが示された。以上、抗TNC抗体はヒト体内においても腫瘍組織に特異的に集積し、長時間停留する可能性が示唆された。よって、抗TNC抗体は標的認識ユニットとして有用であることが判明し、当初の開発目標を十分達成できたと考える。
英文要約Title: R&D Project on Molecular Imaging Equipment/Development of Core Technology on Novel Molecular Imaging Probes for Malignant Tumor Detection/Development of Elemental Technology for Molecular Imaging Probes (FY2008-FY2009) Final Report
In vivo imaging of cancer in its early stage is worthwhile not only for earlier diagnosis but also for clinical treatment. In the carcinogenesis of epithelial cells, it is thought that the surrounding mesenchyme found around the epithelial cell (also known as the stroma), and in particular, the large molecular groups known as the extracellular matrix play a pivotal role. The extracellular matrix is an assembly that consists of various physiological substances such as collagens; laminin and type IV collagen which compose the basement membrane; as well as tenascin-C (TNC), a glycoprotein with high molecular weight. TNC is found in the cancer matrix and surrounding mesenchyme as a hexamer and is known to be expressed in a spatio-temporal manner in the processes of organogenesis, tissue regeneration, wound healing, cell proliferation, infiltration and metastasis. Normally produced by fibroblasts, TNC production has been confirmed in epithelial cancerous cells, the implication being that this production of TNC in cancerous cells is induced by a humoral factor deriving from the mesenchyme around cancer, designated the TNC-inducing-factor, TIF. Therefore, TNC and TIF may be promising target molecules for in vivo imaging of tumors. The purpose of the present project was to develop a suitable in vivo imaging probe utilizing both anti-human-TNC (hTNC) and anti-TIF antibodies. Firstly, the rat monoclonal antibodies (rMabs) to hTNC were selected from our anti-hTNC rMab library by immunohistochemical screening against tumors developed from human cancer cells, A375, 2008 and HKBMM. Out of a total of fifteen, eleven rMabs were hTNC-specific and four of them were human and mouse TNC cross-reactive. To examine the specificity of these rMabs to TNC in vivo, two rMabs, RCB1, hTNC-specific, and DEAR1, human and mouse TNC-cross-reactive, were labeled with Alexa488, Cy5, Cy5.5 and IRDye800, respectively, and administered to tumor-bearing mice. The results indicated that only Cy5.5 and IRDye800 labeled rMabs exclusively accumulated in the tumor. Furthermore, five rMabs, RCB1, DEAR1, DEAR2, 12-2-7 and 3-8-9 were labeled with either SiR700 or Cy5.5 to examine their localization in tumor-bearing nude mice. These rMabs were exclusively accumulated in the tumors except for DEAR1, which localized to both the tumor and joint ligaments. Of interest, the fluorescence of SiR700 and Cy5.5 in the tumor was detectable 240 hours after injection. These rMabs clearly showed the boundary between the tumor and its surrounding connective tissue. Histological observations with a laser scanning microscope further revealed that the fluorescence localized in the cancer matrix. Moreover, the immunohistochemical examination using FITC-labeled anti-rat antibody showed that these rMabs remained in the cancer matrix. Taken together, these data indicate that TNC is a suitable target molecule for in vivo imaging of tumors.
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