成果報告書詳細
管理番号20110000000149
タイトル平成19年度~平成21年度成果報告書 基礎研究から臨床研究への橋渡し促進技術開発/レギュラトリーサイエンス支援のための実証研究/再生医療材料の安全性の確立と規格化及び臨床研究への応用
公開日2011/6/7
報告書年度2007 - 2009
委託先名国立大学法人京都大学 アルブラスト株式会社 財団法人先端医療振興財団 三菱化学メディエンス株式会社
プロジェクト番号P07022
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約我が国における再生医療に関する基礎研究や臨床研究には、日本発の優れた研究があるものの、これらの実用化については、先進諸外国と比べ大きく遅れを取っている。この原因の一つとして、細胞移植による感染症や癌化のリスクに関して、規制当局と開発者の双方の間で安全性の評価方法や基準の共有化がなされていないことが考えられる。したがって、科学的知見の進展に歩調を合わせたレギュラトリーサイエンスが必要である。そこで本事業では、既に多施設で臨床研究に使われている骨髄由来の間葉系細胞、及び新しいソースとして注目されている臍帯由来の間葉系細胞を対象として安全性に関する実証研究を実施した。まず、製造工程の安全性を検証するため、41例の骨髄液を原材料とし、大気酸素濃度下と低酸素濃度下で間葉系細胞の培養を行い、細胞の継代を繰り返す、培養試験を実施した。低酸素下では細胞の増殖速度が増加する傾向を示し、いずれの条件下においても全検体で培養細胞は老化し、増殖を停止することを確認した。また、18例の臍帯由来間葉系細胞の培養を実施し、骨髄由来間葉系細胞に比べ増殖速度が速く、細胞寿命が長いことを明らかにした。次に、間葉系細胞の感染性因子による汚染のリスクを検証するため、ウイルス・マイコプラズマ試験の標準的な試験系を確立し、13種類のウイルスとマイコプラズマの培養工程における動態を解析した。原材料とした骨髄液でウイルス陽性の検体を認めたものの、培養工程によりウイルスDNA量は減少し検出されなくなることを確認した。一方、4種類のウイルススパイク試験の結果より、サイトメガロウイルス(CMV)は間葉系細胞に感染しウイルスを産生することから、間葉系細胞の培養における品質管理項目としてCMV検査は必須であると思われた。さらに、培養工程における間葉系細胞の形質転換と造腫瘍能獲得のリスクを検証するため、41例の骨髄由来間葉系細胞と17例の臍帯由来間葉系細胞の経時的な核型解析を実施した。骨髄由来間葉系細胞については、大気酸素濃度下、低酸素濃度下で培養した間葉系細胞の核型異常の発生頻度を比較した。その結果、培養環境の酸素濃度、骨髄液ドナーの年齢、継代数が核型異常を生ずる頻度に影響を及ぼしうることを明らかにした。また、細胞の癌化に関連して、テロメラーゼとその発現調節因子について、発現量解析を行った。間葉系細胞におけるこれらの遺伝子発現量は、核型異常の有無により差異は認められず、陽性対照とした小児由来の腫瘍細胞の遺伝子発現とは明らかに異なっていた。さらに、核型異常を呈した5例の骨髄由来間葉系細胞を、免疫不全動物であるNOGマウスに移植し、その造腫瘍性を検証したが、造腫瘍能は認められなかった。以上より、核型異常を造腫瘍性と直結する指標として捉えることに関しては慎重な議論が必要であると結論した。細胞製剤の製造は、セルプロセッシングセンター(CPC)で行われるが、その製造管理、品質管理、衛生管理を行うために必要なCPC図書の整備は再生医療を実践するうえで必須となる。本事業では、CPC図書の雛型を作成し、上記の成果を取り込み手順書とするための基礎を築き、雛型としての有効性を実製造により確認した。これらの科学的エビデンスに基づき、規制当局への提言内容の骨子を決定した。
英文要約Title: Translational Research Promotion Project. Establishment and standardization for safety of cellular-based and tissue-engineered medical products and application for clinical practices. (FY2007-FY2009) Final Report
Kyoto University, ArBlast Co., Ltd, Mitsubishi Chemical Medience Co., Ltd, Foundation for Biomedical Research and Innovation
Mesenchymal stem cells (MSCs)-mediated tissue regeneration is a promising approach in regenerative medicine for a wide range of clinical applications. To establish a standard for safety of such cellular-based medical products, we analyze dynamic change of various viruses, mycoplasmas, chromosomal aberration ratios, and gene expressions in MSCs. ArBlast Co., Ltd compared the growth of bone marrow derived MSCs from 32 patients under different oxygen concentrations. Growth of MSCs was stimulated in a low-oxygen (5%) in most cases. Tsurumi University School of Dental Medicine cultured umbilical cord-derived MSCs from 10 donors. The growth rate was the highest in passage 2 to 4. PDs reached plateau with passage 12 to 14. Mitsubishi Chemical Medience Co., Ltd analyzed the viruses and mycoplasmas in MSCs among culture process. Viruses(13 species)and the mycoplasma were tested from 38 lots of the marrow and the umbilical cord-derived MSCs. ParvoB19 virus was detected in the marrow of four lots, EBV and HTLV-1 were respectively detected in that of one lot. Amount of the virus DNA decreased or disappeared through culture, and mycoplasma was not detected at all. Tokyo Medical and Dental University developed the virus spike test system for four viruses (HIV,CMV,EBV,PVB19). The viral genome, mRNA, and protein analyses for each virus demonstrated that the MSCs have susceptibility to CMV but don’t have it to PVB19. ArBlast Co., Ltd. and National Center for Child Health and Development examined the chromosomal change and the expression of TERT and TERT-related genes (Ets, C-Myc, Sir2 and SIP1) in MSCs cultured in 5% and 21% oxygen conditions. Chromosomal aberrations were observed in both culture conditions in long-term cultures (6 cases out of 17 cases) TERT transcripts were detected in MSCs isolated from the carcinoma(12 cases), but not normal tissues(89 cases). The transcripts of four TERT-related genes were detected in all MSCs as well as that of carcinoma. The Foundation for Biomedical Research and Innovation (FBRI) made the “filling form” for the Product Specification, the Manufacturing Control Standards, the Quality Control Standards, and related Standard Operation Procedures (SOP)s and Records used in the CPC during the production. FBRI performed the culture of MSCs in the FBRI’s CPC 8 times to prepare these documentations. Kyoto university compared the safety guidelines among Japan (MHLW-PMDA), the United States, and the EU with relate to the cellular therapy. On the basis of the studies in survey of the comparison of safety guidelines, the Japanese guideline issued from MHLW regarding the principle safety assessment of autologous cell therapy and the actual hurdles which sponsors are facing with was compared. As a result, it was revealed that issues including nucleus assessment of the cellular products, virus and mycoplasma testings as mid-process assessment, and tumorigenicity should be discussed and commented in addition to the existing guideline.
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