成果報告書詳細
管理番号20110000000697
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発/微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発/高性能宿主細胞創製技術の開発、微生物反応の多様化・高機能化技術の開発、バイオリファイナリー技術の開発、総合調査研究/大腸菌DGFの研究開発
公開日2011/6/7
報告書年度2006 - 2010
委託先名協和発酵キリン株式会社
プロジェクト番号P06014
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約 染色体大規模加工を行い、より高性能な宿主細胞作製を進めた。高性能宿主細胞の究極的な目標像としては、人為的な代謝設計通りに働く細胞工場を想定しており、そのような高性能宿主細胞をデザインドゲノムファクトリー(Designed Genome Factory, DGFと略称する)と称する。
 本研究開発開始時点で構築済みであった染色体縮小化株MGF-02から更に約500 kbp長の染色体領域を削除し、染色体長2.98 MbpのDGF-298株作製に成功した。本菌株のゲノムリシーケンシングを実施し、IS(インサーショナルシーケンス)がすべて設計通りに削除されていることを確認した。
 遺伝子機能解明について、国立遺伝学研究所との共同研究を進めた。機能未知遺伝子yfgAとybgTの2つの遺伝子は、MGF-01WS株(MGF-01株の改良株)を親株とした場合、破壊することができず、必須性が高い遺伝子であることが示唆された。2つの遺伝子のうち、yfgAについては、大腸菌細胞の桿菌形態を維持するために必要な遺伝子であった。また、yfbQ、yfdZ遺伝子はアラニン合成を司るアミドトランスフェラーゼをコードすること、yhhKがパントテン酸生合成に係る遺伝子であることを明らかにした。別途、機能未知遺伝子群の欠失可能性を実験的に検証し、削除できない機能未知遺伝子数が83であると結論した。この数字は、DGF-298株の全遺伝子数(2659)の3.1%であった。
 染色体縮小化株の機能強化に関して以下の結果を得た。大腸菌K-12株がもともと保有している代謝上の変異点2点を同時に野生型に復帰させると(S化)菌株の生育が向上した。トキシン遺伝子(発現すると細胞を自ら破壊する遺伝子群)の中でhipABを欠失させることで酸化ストレスが引き金になる細胞死の遅延効果があることを見出した。作製した一連の染色体縮小化株のATP供給能力を測定したところ、染色体縮小化に伴い、細胞あたりのATP供給能力が高まっていることが判明した。
 高度な遺伝子発現制御が可能なプロモーターの探索・開発について奈良先端科学技術大学院大学との共同研究を進めた。奈良で開発された精度の高い転写解析可能なタイリングアレイを用いて、プロモーターの探索・評価を行った。培養途中で誘導されるyodプロモーターを利用した場合には、アルギニンの生産速度の最大値が3.29 g/l/hであり、Corynebacterium属細菌でのアルギニン発酵で報告されている0.85 g/l/hを大きく上回った。
 また、染色体縮小化株は、ニコチアナミン、グルタチオンなどATPを補因子として必要とする物質生産(酵素反応)に有用であることを証明した。特にニコチアナミン生産においては、化学合成法を凌駕する生産性を示すことができた。
 今後は開発した要素技術を自社ならびにグループ企業で活用すると同時に、菌株ライセンスアウトなどを通した技術普及に努める。
英文要約We have constructed a high-performance Escherichia coli host strain using a genome reconstruction approach. One of goals of the high-performance host strain is a cell factory working as we design. We call this cell factory system as Designed Genome Factory (DGF).
We have succeeded to construct an E. coli strain with a reduced-size genome of 2.98 Mbp. The genome was re-sequenced and found to have no IS (insertional sequence) as a result of designed deletions of ISs.
Important functionally unknown y-genes have been analyzed in collaboration with the National Institute of Genetics. Firstly, we found that yfgA and ybgT are essential genes for a reduced-genome strain MGF-01WS (a derivative of MGF-01). The gene ygfA is required to maintain the rod shape of E. coli. Secondly, yfbQ and yfdZ were revealed to encode amidotransferases for alanine synthesis. Thirdly, yhhK was found to encode a protein for accelerating maturation of PanD required for pantothenic acid biosynthesis. On the other hand, single gene deletions from MGF-01WS suggested that there may be 83 important y-genes conserved on the genome of DGF-298, of which deletions may cause sick phenotype. The number 83 means only 3.1% of total genes of DGF-298.
Several improvements have been done in this research to functionally activate reduced genome strains. Replacement of 2 mutations of ilvG and pyrE to functionally intact alleles was proven to improve growth of the reduced-genome strains. Deletion of hipAB, one of toxin-antitoxin gene pairs, was found to prolong cell life of E. coli under oxidation stress. ATP-supply activity of reduced-genome strains is increased at several points of genome reductions. It is expected that reduced-genome strains possess potential for fermentative production.
E. coli’s promoters have been screened in collaboration with the Nara Advance Institute for Science and Technology for strict regulation using DNA-tiling array chips designed in this collaboration. An inducible promoter, Pyod, can produce arginine from the mid-phase of cultivation and accelerate its production rate up to 3.29 g/l/h that is higher than the reported record of 0.85 g/l/h by Corynebacterium sp.
We have also revealed that reduced-genome strains are useful for producing chemicals that are enzymatically synthesized using ATP as a co-factor. Especially nicotianamine production level is higher than that of an authentic chemical process.
Developed materials and technologies will be used in Kyowa Hakko Kirin and its related companies. And also we will open the materials and technologies if with general contracts.
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