成果報告書詳細
管理番号20110000000717
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発/微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発/バイオリファイナリー技術の開発
公開日2011/6/7
報告書年度2006 - 2010
委託先名財団法人地球環境産業技術研究機構
プロジェクト番号P06014
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約本プロジェクトでは、経済性優位なるバイオリファイナリー産業の早期実現を目指し、独自の革新的なバイオプロセス「増殖非依存型バイオプロセス」をコア技術として、ソフトバイオマス由来の糖を原料とした基幹化学物質製造工業プロセスの基盤技術を確立した。 (1)ソフトバイオマスの糖化技術の開発: バイオマス糖化技術の鍵となる高機能セルラーゼの開発として、セルロソーム成分の改良および最適化を行った。一方、耐熱性セルラーゼの取得とその特性・構造の解明、酵素の耐熱性向上・活性向上技術の基盤となる変異導入法の開発等を行った。また、高機能酵素遺伝子の取得方法としてメタゲノム的手法の基盤技術の開発を行い、新規セルラーゼを取得した。人工セルロソームの基盤開発として、セルロソーム成分を有用工業微生物であるコリネ型細菌において発現させ、細胞外に分泌されることを確認した。さらに、コリネ型細菌の新規分泌シグナルや高分泌能変異株を取得し、これを利用して異種蛋白質高効率分泌システムを確立した。高効率糖化プロセスの開発として、酵素再利用法による連続糖化システムを構築し、市販酵素を用いたリグニン含有古紙の連続糖化を確認した。また、市販酵素にセルロソームを添加した場合の糖化能の相乗的な促進効果を確認した。 (2)増殖非依存型バイオプロセスの開発: コリネ型細菌は還元条件下において増殖は停止するものの主要な代謝系は維持され機能する性質を持ち、さらに、非増殖条件下では増殖条件下よりも、細胞当りの代謝活性が高く、より高い物質生産能力を有する。本研究ではこの増殖非依存型バイオプロセスに関連する様々な遺伝子の機能および発現制御機構を解明し、その知見を利用してバイオマス由来糖類からの各種化合物高効率生成システムの基盤技術開発を行った。糖代謝関連遺伝子の欠損株・高発現株の糖代謝活性の解析に基づき非増殖条件下で糖消費速度が向上する遺伝子改変株が得られ、また、解糖系酵素の発現量の改変による糖代謝機能強化の基盤要素技術を確立した。各種化合物(有機酸、糖アルコール、アミノ酸)の生産細胞を構築し、上記糖代謝能強化に加え、補酵素再生系の改変による細胞内酸化還元バランスの最適化や、各種共存可能プラスミド・プロモーターの開発による代謝遺伝子発現レベルの最適化等、増殖非依存型バイオプロセスにおける生産性向上のための基盤要素技術を確立した。これらの技術開発により、D-乳酸、L-アラニン、キシリトール、バリンについて、従来の発酵プロセスを上回る高い生産性を達成した。 (3)トータルシステムの開発: 各種工業微生物を用いたバイオマス由来糖類変換技術の開発において、糖化過程で生じる発酵阻害物質に対する耐性とC6/C5混合糖の効率的同時利用が大きな技術課題となっている。本研究において、増殖非依存型バイオプロセスでは発酵阻害物質の影響は極めて小さいことが示された。また、コリネ型細菌の糖利用能改変により、グルコース、キシロース、アラビノース、セロビオース、マンノースの完全同時利用が可能となった。上記の各種化合物生成システムと統合することにより、ソフトバイオマス由来混合糖液からD-乳酸、キシリトール、バリンが高効率で生成することを確認した。 (4)ベンチプラントによる実証試験: 増殖非依存型バイオプロセスの早期工業化を目指し、スケールアップの検討を行った。10 L容量のジャーファーメンターを用いて反応を行ったところ、フラスコスケールレベルと同等以上の生産性が得られた。
英文要約Title : Development of fundamental technology for environmentally friendly production using microbial cell functions/ Development of fundamental technology for advanced production using microbial cell functions/ Development of biorefinery technology (FY2006-FY2010) Final Report
(1) Development of saccharification technology from soft biomass: With regards to development of highly-functional cellulases, we succeeded in expression and secretion of cellulosome components in an industrially useful microorganism, Corynebacterium glutamicum. This heterogeneous protein secretion system was improved by using a newly obtained signal sequence and a mutant with high secretion ability. On the other hand, we structurally and enzymatically characterized cellulases with high heat-resistance. New cellulases were also identified from some environmental DNA libraries constructed. With regards to development of highly efficient saccharification process, we constructed an enzyme-recycling system employing commercially available cellulase, and observed continuous saccharification of lignin-containing used paper. In a batch reaction, a mixture of cellulosomes and a commercially available cellulase exhibited synergistic positive effects on saccharification of the substrate. (2) Development of growth-arrested bioprocess: When C. glutamicum cells are cultured under oxygen deprived conditions, the growth-arrested cells maintain their main metabolic capabilities. We investigated various cell functions related to this unique property of C. glutamicum in order to develop a new bioprocess leading to establishment of a biorefinery with superior cost competitiveness. Genetic engineering of sugar metabolism resulted in an increased rate of sugar consumption in the growth-arrested bioprocess. We constructed recombinant strains for production of various compounds (organic acids, sugar alcohols, and amino acids). Fundamental technologies for high productivity were established; improvement of the intracellular redox balance by engineering of the coenzyme regenerating system; optimization of expression levels of the relevant genes by newly developed plasmid vectors and promoters; in addition to the reinforcement of sugar metabolic capability described above. As results, highly efficient productions of D-lactate, L-alanine, xylitol and valine were achieved. (3) Development of the total system: As for development of biorefinery using various industrial microorganisms, simultaneous utilization of C6/C5 sugars and tolerance to fermentation inhibitors are technological key-points hard to be overcome. However, we observed that the growth-arrested bioprocess is highly resistant to the presence of the fermentation-inhibitors. Furthermore, genetic engineering of C. glutamicum enabled the completely simultaneous utilization of glucose, xylose, arabinose, cellobiose, and mannose. We also observed efficient production of D-lactate, xylitol and valine from mixed sugars derived from lignocellulosic biomass. (4) Bench-scale experiments for the growth-arrested bioprocess: We constructed a bench-scale system for the growth-arrested bioprocess and observed high productivity comparable to that of a flask-scale system.
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