成果報告書詳細
管理番号20110000000719
タイトル平成22年度成果報告書 微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発/微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発/高性能宿主細胞創製技術の開発、微生物反応の多様化・高機能化技術の開発、バイオリファイナリー技術の開発、総合調査研究/酸素添加酵素の高機能化・多様化技術の研究開発
公開日2011/6/7
報告書年度2006 - 2010
委託先名メルシャン株式会社
プロジェクト番号P06014
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約進化工学的および構造ベースの理論的アプローチにより25位水酸化活性が向上しかつ副反応の26位水酸化が低減したビタミンD3水酸化酵素(Vdh-K1/I88V)を創製した。さらに、P450反応の促進に関わる遺伝子を最適化したシュードノカルディア宿主株を樹立した。それらの宿主のひとつにVdh-K1/I88Vをコードする遺伝子をインテグレートさせたものは親株に比較して有意にカルシトリオールの生産性が増加した。別のアプローチでは、抗菌物質ナイシンで処理したロドコッカス細胞を用いた高効率ビタミンD3変換系の構築を行った。ナイシン処理細胞による64時間の反応により、生細胞による変換の6倍の水酸化VD3を得る事に成功した。:野生型ビタミンD3水酸化酵素(Vdh)、および進化工学により活性が大幅に向上した四重変異体(Vdh-K1)の結晶構造解析を行った。結晶構造解析および基質結合スペクトルアッセイの結果、これら4カ所の変異導入により全体構造が大きく変化し、それによって基質との親和性が飛躍的に向上したことが明らかになった。また、Vdh-K1とビタミンD3(VD3)および25水酸化ビタミンD3との複合体構造解析に成功し、本酵素がそれぞれの基質を上下反転した方位で活性部位に取り込めることが明らかになった。この異なる二種の基質認識モードの存在は、本酵素がVD3の25位および1α位を部位選択的に連続水酸化する機構を説明する。:大阪大学では酸素添加酵素が機能する反応の場を制御することで、その力価を増大させることを目標に研究を実施してきた。この際、細胞内とリアクターという異スケールの反応場を研究対象とした。細胞内反応場の解析・制御では大腸菌1遺伝子破壊株ライブラリーを宿主とし、レポーターP450の活性を向上させうる株の探索を実施した。この結果、cpxA遺伝子破壊株を宿主とした場合、野生株に比べP450の活性向上を見出し、その原因がラクトース誘導型プロモーターからの転写量増大にあることを明らかにした。一方、リアクタースケールでの検討では、酸素添加反応に供される基質の多くが難水溶性物質であることに着目し、有機溶媒存在下での微生物反応の効率化を目指した。この結果、Rhodococcus opacus B-4株(Rop)に代表される親油性細菌を用いることで、難水溶性基質と菌体との接触効率を高く保ち、反応の効率化が可能となることを実証した。:細菌の有機溶媒耐性能は、疎水性ケミカルのバイオ生産に大きく寄与する生物機能である。しかし、グラム陽性細菌の有機溶媒耐性機構はほとんど解明されていない。そこでゲノム解読が終了しているRopを対象に有機溶媒耐性機構の解明を行った。まず、有機溶媒耐性への関与が予測されていた環境ストレス応答型のシグマ因子SigBが実際に有機溶媒耐性に関与することを実験的に証明した。ついで転写がSigB支配下にある遺伝子群を探索した結果、細胞表層に存在するActinobacteriaに特徴的な長鎖脂肪酸ミコール酸の生合成系が有機溶媒耐性に必要であることを発見した。また、ゲノムに多数存在する多剤耐性排出ポンプのうちEfp21とEfp22が有機溶媒耐性に寄与することを発見した。Efp21およびEfp22は実際に有機溶媒の排出機能を持つことを実験的に明らかにした。
英文要約Title: Projects on development of basic technologies for advanced production methods using microorganism functions. Research on oxygenases for functional optimization and diversification (FY2006-FY2010) Final Report
Directed evolution and structure-based rational approach created the improved vitamin D3 (VD3) hydroxylase which has a high hydroxylation performance (high activity for C25 and low undesirable activity for C26; Vdh-K1/I88V). We established genetically-engineered host strains of Pseudonocardia autotrophica in which genes involved in enhancing the P450 reaction were optimized. One of the strains with an integrated gene for Vdh-K1/I88V showed the significantly increased productivity of calcitriol compared with the parent strain. In alternative approach, we have developed a novel bioconversion system using the nisin-treated Rhodococcus erythropolis cells. It yields six times more 25(OH)VD3 after 64 hr reactions than the conventional bioconversion by the living cells.: Crystal structures of wild-type VD3 hydroxylase and its highly active quadruple mutant (Vdh-K1) generated by directed evolution have been determined. The results indicate that the conformational equilibrium was largely shifted towards the closed form by four amino-acid substitutions, thereby dramatically increasing substrate-binding affinities. The substrate-bound structures of Vdh-K1 accommodates both VD3 and 25(OH)VD3 but in an anti-parallel orientation. The occurrence of the two secosteroid binding modes accounts for the regio-selective sequential VD3 hydroxylation activities.: Single-gene knockout collection of Escherichia coli was screened for mutants that could enhance the activities of heterologous P450s. The cpxA-deficient mutant was found to be able to enhance the activity of various P450s. The enhanced activity was attributed to the increased transcriptional levels of the gene coding for the enzyme. For improving the conversion rate of water-immiscible substrates, Rhodococcus opacus B-4 (Rop) was used as a whole-cell catalyst in the presence of organic solvents. Rop cells preferably adhered to the organic phase of aqueous/organic two phase mixture and were dispersible in water-free organic solvents. Due to their lipophilicity, Rop cells had high accessibility to substrates in organic solvents and showed high performance in their conversions.: Mechanisms underlying organic solvent tolerance in Gram-positive bacteria are not clear. In Rop, genetic analysis revealed that SigB, stress-responsive alternative sigma-factor, is involved in organic solvent tolerance. We then investigated genes of which transcription is controlled by SigB and found that mycolic acid biosynthesis is involved in organic solvent tolerance. We also found that putative multidrug resistant efflux pumps Efp21 and Efp22 are required for organic solvent tolerance. Physiological analysis reveled that Efp21 and Efp22 actually function as efflux pumps of organic solvents such as toluene and hexane.
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