成果報告書詳細
管理番号20110000000720
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発/微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発/高性能宿主細胞創製技術の開発、微生物反応の多様化・高機能化技術の開発、バイオリファイナリー技術の開発、総合調査研究/高効率酵素設計のための酵素反応シミュレーション技術の研究開発
公開日2011/6/7
報告書年度2006 - 2010
委託先名日本電気株式会社
プロジェクト番号P06014
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約従来からのランダム変異による酵素の高効率化手法を大きく加速するために、分子シミュレーションによる分子設計手法を相補的に利用することは有効である。本研究では、新しい分子シミュレーション理論の構築することにより、アミノ酸置換に伴う活性化自由エネルギーなどの物理化学的変化を定量的に予測する基盤技術を開発することを目指した。この技術は、部位特異的変異手法による効率的酵素の設計を可能にする。本研究では複数の異なる分子シミュレーション手法の開発を行った。第一に、反応効率の評価のために重要な遷移状態の電子状態を計算するために、高度な分子軌道法であるCASSCF法やCASSCF-DFT法の基本的モジュールを構築した。第二に、望ましいアミノ酸配列を決めるに、反応中間体に対する高性能の複合体モデリング技術やスコアリング技術を構築した。この技術における望ましいアミノ酸配列とは、P450の複合体構造上で、目標生成物の結合配座にとっては有利である一方、副反応物の結合配座にとっては不利になる配列である。第三に、分子シミュレーション性能評価と有用性実証のためにラマン分光取得システムを構築した。本技術の有効性実証のために、メルシャン社のP450水酸化酵素に対して、目標生成物の生産効率化と副生成物制御のためのアミノ酸配列の予測を行った。まず、P450の酵素反応メカニズムの特性を解析するために、(1)基質結合過程、(2)水酸化反応、(3)反応生成物解離過程を含む酵素反応の一連の流れに対するシミュレーションを実施し、反応プロセス全体を視覚化することに成功した。特に、水酸化反応の解析では、P450の反応活性種と推測されているcompound Iの2種類の構造(Perferryl-oxo種とFerryl-oxo種)に対して反応機構を詳細に検討した結果、P450の反応機構におけるいくつかの謎を解明する手掛かりを得ることができた。変異体設計に関しては、第一段階は、これまでに構築したシミュレーション技術や解析された反応メカニズムに基づいて、メルシャン社による変異実験の結果(活性向上、副反応抑制)を論理的に理解することを試みた。その結果、活性を向上させる変異は、構造揺らぎを拡大する効果があることや、結合サイト入口で塩橋を形成する効果があることが説明できた。副反応制御する変異は、立体障害を低減する効果があることが定量的に説明できた。次の段階では、P450の新規基質に対する副反応制御のための変異予測を実施し、7個の変異位置候補のアミノ酸配列を提案した。その後の実験結果により、4個で副反応を抑制できること(成功率57%)が明らかになった。これは、ランダム変異に比べて遥かに高い成功率である。また、最も優れた変異体は、副反応を約1/3に抑制できることに成功した。この予測結果により、本技術が変異予測に有用であることが実証された。
英文要約Title: Development of Basic Technologies for Advanced Production Methods Using Microorganism Functions. Development of simulation methods of enzymatic reactions for designing highly efficient enzymes. (FY2006-FY2010) Final Report
Combination of experimental random mutation and enzyme design by a simulation is effective approach for developing a high performance enzyme. In this project we aimed to develop basic technology for predicting the physicochemical changes caused by mutations, such as activation free energy, quantitatively. This basic technology allows us to design the high performance enzyme in a site-specific manner.We developed various molecular simulation methods. First, basic modules for CASSCF or CASSCF-DFT method were constructed to elucidate an electron state of transition state, which is important for estimating the reaction efficiency of enzyme activity. Second, structure modeling method of protein-ligand complex for reaction intermediate and scoring method for estimating preferable interactions were constructed to select desirable amino acid sequences, which generate a favorable binding conformation for main product and an unfavorable for residual product. Third, Raman spectroscopic system was constructed to validate the constructed molecular simulation methods.To validate our developed methods, we applied them to predicted Cytochrome P450 (CYP) enzymes developed by Mercian Corp. This enzyme has Vitamin D3 hydroxylation activity. In first stage, a series of simulations including (1) substrate binding, (2) hydroxylation reaction and (3) product dissociation were performed to elucidate the mechanism of reaction. Consequently, we succeeded in visualizing overall reaction process. Especially, it is interesting that the mechanism of hydroxylation reaction was suggested by quantum chemical simulations for two states of compound I (perferryl-oxo and ferryl-oxo), which are active species. In next stage, we performed mutation prediction. First, we tried to understand the effect of mutations discovered by Mercian Corp using our constructed methods. As a result, we found that mutations for enhancing activity increase structural flexibility or form salt bridge at the entrance of binding site and mutations for suppressing side reaction decrease steric hindrance. Next, mutation prediction for suppressing side reaction for novel substrate suggested seven candidates of mutation site. Measurement of activity showed that four candidates suppress side reaction, i.e, success rate 57%, and the most excellent mutant succeeded in suppression by one third relative to existing enzyme. Consequently, it is shown that our methods are effective for development of enzyme.
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