成果報告書詳細
管理番号20110000000723
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発/微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発/高性能宿主細胞創製技術の開発、微生物反応の多様化・高機能化技術の開発、バイオリファイナリー技術の開発、総合調査研究/分裂酵母高性能宿主細胞創製技術の研究開発
公開日2011/6/7
報告書年度2006 - 2010
委託先名旭硝子株式会社
プロジェクト番号P06014
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約われわれは、菌体増殖や物質生産に不要な遺伝子を染色体から取り除き、目的物質の生産効率化に貢献するという、ミニマムゲノムファクトリーのコンセプトに基づいた宿主細胞の改良を行なった。本研究では、実験操作や培養技術が発達している微生物の中でも、高等動植物細胞と類似する発達した細胞内構造や機能を持ち合わせた真核生物である分裂酵母に着目し、その染色体を大規模に改変した染色体末端削除株を作製した。外来遺伝子機能安定導入技術開発として、外来の多数の有用形質を宿主細胞に効率的に付与することを可能とする染色体改変技術の開発を目的とし、分裂酵母染色体上に多数の外来遺伝子発現ユニットを簡便に組込み、かつ安定に保持することが可能である技術開発を行なった。その結果、外来遺伝子を組込むことに最適な遺伝子座を特定するとともに、最大5コピーの発現ユニットを一度に組込むことが可能であることを見出した。また、遺伝子発現制御機能付与技術開発として、外来の有用形質を効率的に発現することを可能とする技術開発を目的とし、薬剤添加による誘導型プロモーターや外部信号による制御が可能なプロモーターの取得と、その配列の最適化に取り組んだ。その結果、熱ならびに多様なストレスによって外来遺伝子の発現が誘導される系を確立し、培養後期に特異的に発現するプロモーターの取得に成功した。さらに、エネルギー供給系の解明と最適化技術開発の一環として、染色体大規模削除株作製技術開発においても、分裂酵母染色体から一度に100kbpを超える領域を削除する際に、増殖性能が野性株と比べて遜色ない削除株を効率よく取得することに成功し、野性株から657.3kbpの領域を削除することに成功した。得られた大規模削除株は野生株と同等の増殖性能を示すとともに、異種タンパク質生産性が1.7倍から3.2倍に向上したことが、モデル化合物であるヒト成長ホルモンならびにトランスフェリンを用いた検討から明らかになった。一方、分子シャペロン群の解明と最適化技術開発、小胞体ストレスの検出・回避技術開発を統合した異種タンパク質分泌生産性向上技術開発において、複数の薬剤を添加することによってトランスフェリンの分泌生産量が上昇する条件を特定し、さらにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼPdi1や低分子量分子シャペロンHsp16遺伝子の過剰発現よっても、分泌生産量が上昇することを見出した。同時に小胞体ストレス応答であるERADを軽減する変異株において、同様の効果があることが見出された。ゴルジ体における翻訳後修飾系の制御技術開発としては、omh1遺伝子破壊株によるO-結合型糖鎖構造の最小化ならびにgms1och1およびalg3och1遺伝子破壊株によるN-結合型糖鎖構造の最小化を実現した。またガラクトース転移酵素10個の完全破壊株の作製にも成功し、外来のα-1,2-マンノシダーゼ発現系も構築されたことから、ヒト型糖鎖の元になる構造であるバイアンテナ型糖鎖付加タンパク質の効率的な生産が、分裂酵母内で可能になったことが示された。
英文要約Fission yeast is an attractive host for molecular and cellular biological research. This yeast grow by fission as like as mammalian and plant cells, different from budding yeast Saccharomyces cerevisiae. A series of expression vectors was constructed which enables intracellular or extracellular production of recombinant proteins, constitutive or inducible expression of foreign gene, and extrachromosomal or intrachromosomal maintenance of expression cassette in S. pombe. It is necessary, however, to improve the system to be cost-effective production of commodity chemicals such as ethanol and lactic acid, so that the host becomes more productive and will be widely used for the production of various types of enzymes. We hypothesized that many S. pombe genes are not necessary under nutrient-rich growth conditions; or rather, they serve only to waste energy when seen from the viewpoint of protein or chemicals production, because their products are necessary only for adaptation to different environments. We have created S. pombe mutants that are dedicated to recombinant protein production by deleting as many non-essential genes mainly located on the ends of chromosome 1 and 2 as possible. Putative essential genes were mapped using the genome project and single gene disruption library information of S. pombe. The transcriptome data by DNA microarray was also used. The method called "Latour" has been developed to delete efficiently a large region from the chromosome, resulting in the establishment of mutant strains lacking 657.3 kbp of genetic material. The expression levels of model proteins such as GFP and human growth hormone using chromosome deletion strain showed higher than that of wild type. These results indicated that the chromosome minimization strategy is a first step related to the improvement of productivity. Several functions effective for recombinant protein production, such as human-type glycosylation and molecular chaperons were integrated to this "Intelligent Genome Factory". Therefore, the S. pombe expression system can be one of the powerful systems to produce various types of recombinant proteins at a high level.
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