成果報告書詳細
管理番号20110000000724
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発/微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発/高性能宿主細胞創製技術の開発、微生物反応の多様化・高機能化技術の開発、バイオリファイナリー技術の開発、総合調査研究/非水系反応場におけるバイオプロセスの構築
公開日2011/6/7
報告書年度2006 - 2010
委託先名ダイセル化学工業株式会社
プロジェクト番号P07024
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約1.非水系反応場におけるバイオプロセスの構築(ダイセル化学工業株式会社)有機溶媒耐性Kocuria rhiozophila DC2201の近縁種から複製起点を、高生産タンパク質遺伝子からプロモーターを取得してDC2201の高発現ベクターを構築した。次に、水/有機溶媒二相系反応場における物質生産を行い、 (R)-マンデル酸は211 g/L、(S)-4-クロロ-3ヒドロキシアセト酪酸エチル(ECHB)は補酵素を添加することなく355g/L蓄積できた。2.酵素タンパク質の有機溶媒耐性機構と疎水性化合物変換酵素の研究(岐阜大学)ニトリラーゼ変異体からアミノ酸置換とC末端領域アミノ酸配列の変化が有機溶媒耐性向上に影響を与えることを明らかにした。野生型ニトリラーゼの精製法を改良した。超臨界二酸化炭素条件下で安定に機能を発揮する高温域適合型の4-ヒドロキシ安息香酸脱炭酸酵素をBacillus属細菌に見いだした。イソオイゲノールをバニリンへと変換する新規酵素をPs. putida IE27に見いだし、イソオイゲノールの変換には大腸菌よりDC2201が適することを示した。3.水素利用微生物触媒の開発と反応に関する研究開発(茨城大学)親水性化合物変換反応にK. lactis由来アルコール脱水素酵素(KLB)、疎水性化合物変換反応にRh. erythropolis由来アルコール脱水素酵素(ReADH)を選抜し、ヒドロゲナーゼ・プロモーター制御下にて水素酸化細菌宿主Ra eutropha H16株での機能的発現に成功した。KLBを利用したヒドロキシアセトンの(R)-1,2-プロパンジオールへの変換反応で67.7 g/lのR体生成物(99.85% e.e.)が得られた。さらにReSADH発現株を用いて4-クロロアセト酢酸エチルの(R) - ECHBへの変換を試みたところ、フタル酸ジブチル二相系反応が基質と生成物の毒性軽減に有効で、水系での反応の約22倍の生成量が得られた。4.非水系生体触媒への水素酸化能付与に関する研究(東京大学)有機溶媒耐性微生物にNAD還元型ヒドロゲナーゼ活性保持能を付与して、芳香族酸等の物質生産技術の確立を目指した。DC2201ならびにRh. opacusB4株を用いて水素酸化能の導入を試みたものの、前者ではプラスミドの巨大性、後者では安定性が問題で、形質転換株を得ることができなかった。一方、大腸菌においてNAD還元型ヒドロゲナーゼの発現に成功した。5.メタゲノム手法による複合反応システムデザイン技術の開発(産業技術総合研究所) カテコール分解能を指標に芳香環水酸化酵素遺伝子をライブラリー化し、ナフトエ酸に対する水酸化活性を検討したが、単一サブユニット型酵素、マルチサブユニット型酵素ともに活性は検出されず、活性変異体も得られなかった。マルチサブユニット型酵素は大腸菌を宿主とし、インディゴ生成活性を有することが確認された。6.機溶媒耐性酵素等有用酵素の精製・結晶化・構造化学的研究(兵庫県立大学)Arthorbacter F73およびFusarium sp.AAM1由来2種類のニトリラーゼがネイティブ電気泳動法、質量分析法および動的光散乱法によって、ヘテロな多量体であることを見出した。後者で、いくつかの単一の凝集体成分に分離させることに成功した。Alcaligenes 由来デカルボキシラーゼの結晶構造を2.8 A分解能で決定したところ、酵素活性に必要の亜鉛原子の電子密度が低く、また元素分析では亜鉛原子はモル比で酵素の1/10程度しか検出されなかった。
英文要約Title: Construction of bioprocesses in non-aqueous media (FY2006-2010)
DAICEL:Kocuria rhizophila DC2201(DC2210) has more robust morphological structures for organic solvents. We construct high-expression vector of DC2201. Production of (R)-Mancelic acid and Ethyl (S)-4-Chloro-3-hydroxybutyrate were done using whole recombinant DC2201 cells in an organic-aqueous biphasic media. Co-factor did not leaked out of cell in DC2201. DC2201 is a promising whole-cell biocatalyst host for the production of chemicals in organic-aqueous and neat organic solvent systems. GIFU UNIVERSITY: To enhance the organic solvent-tolerance, random mutation was introduced into the nitrilase gene. In the primary structure of mutant enzymes showing organic solvent-tolerance, various amino acid substitutions were observed, especially, in the C-terminal region. 4-Hydroxybenzoate decarboxylase, showing high stability under high temperature conditions, was found in Bacillus strains. The gene for isoeugenol monooxygenase of P. putida IE27 was expressed in Escherichia coli and DC2201. The enzymatic conversion of isoeugnol by the transformant of DC2201 was superior to that by E. coli transformant. IBARAKI UNIVERSITY:Ralstonia eutropha transformant H16-KLB4, which was expressed NADH dependent alcohol dehydrogenase from Kluyveromyces lactis (KLB), was used for conversion of hydroxyacetone to (R)-1, 2-propanediol as a model experiment of hydrogen-driven bioprocess. Using the cell suspension, 67.7 g/l of the product (99.85% e.e.) was obtained in a jar fermenter under hydrogen atmosphere. The NADH dependent alcohol dehydrogenase from Rh. erythropolis was successfully expressed in Rh. opacus MR11, and the transformant was used for conversion of Ethyl 4-chloroacetoacetate to Ethyl (R)-(+)-4-Chloro-3-hydroxybutyrate as a model reaction of hydrophobic substances. THE UNIVERSITY OF TOKYO: Firstly, solvent-tolerant microorganisms (DC2201or Rhodococcus opacus B4) were selected so that they were endowed with the hydrogen-oxidizing ability (H2-dependent NAD reducing ability). Then, such transformed microorganisms were to be used for the production of aromatic acids and/or long-chain alcohols. However, in the case of DC2201, the size of the plasmid was too big to transform the strain. Also, in the case of Rh. opacus, the stability of the transformed plasmid was too weak. On the other hand, E. coli was successfully endowed with the NAD-reducing hydrogen oxidizing ability. AIST: To develop efficient biotechnological process for the production of value-added aromatic compounds, we aimed to screen aromatic compounds hydroxylases from the metagenome. We have successfully identified numerous catechol-degrading enzymes from which phenol hydroxylases were retrieved. Of the retrieved phenol hydroxylases, one of the multicomponent-type enzymes showed an ability to produce indigo when expressed in E. coli, suggesting the potential usefulness of this enzyme. UNIVERSITY OF HYOGO: Niitrilases from Arthorbacter F73 and Fusarium sp.AAM1, which are highly organic solvent-resistant enzymes, are found to be assembled as a various multimers (4 to 20mer) in solution by native-PAGE and dynamic light scattering methods. The enzyme from Fusarium sp. AAM1 was successfully separated to several homogeneous assembles by a high performance liquid anion-exchange chromatography. The structure of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase was determined at 2.8 A resolution.
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