成果報告書詳細
管理番号20110000000734
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発/微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発/高性能宿主細胞創製技術の開発、微生物反応の多様化・高機能化技術の開発、バイオリファイナリー技術の開発、総合調査研究/枯草菌RGFの研究開発
公開日2011/6/7
報告書年度2006 - 2010
委託先名花王株式会社
プロジェクト番号P06014
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約 本研究開発は、タンパク質分泌生産効率が既存の微生物レベルを超える高性能宿主微生物(RGF:Refined Genome Factory)を創製することが目的である。本研究では以下に記す4つの研究項目に関して成果が得られた。
1)遺伝子機能解析(ゲノム縮小化技術/代謝最適化技術)
枯草菌MGB874株を親株として、27の領域を削除したゲノム縮小株(RGF1334株)を構築した。本株はMGB874株に比べて培養後半で高いセルラーゼ生産能を有しており、培養5日目で生産性が1.2倍に向上した。新たな酵素生産技術としてリパーゼ(LipA)の評価系と発現系を構築した。細胞表層プロテアーゼの欠失によりリパーゼ生産性が1.2倍向上した。
2)特異的遺伝子発現制御(遺伝子制御技術)
タンパク質分泌装置に関連する遺伝子を単一オペロンに集約化する事でセルラーゼ生産性を1.2倍に向上できた。枯草菌MGF874株と野生株のメタボローム解析を行った結果、グルタミン酸代謝に関与するrocG遺伝子の制御が鍵であると考えられた。そこで、rocG欠失株を構築し、更にアンモニア流加培養による評価を行った結果、MGB874株の1.5倍に生産量が向上した。更に、細胞内のアンモニア代謝系遺伝子の改良により、最終的にMGB874株の1.7倍にまで生産量を向上させる事に成功した。更なる酵素生産量向上のため、窒素代謝に加え炭素代謝の制御技術を構築した。酵素生産に最適な炭素消費速度に制御するため、主要マルトーストランスポーターであるMalPの発現量を誘導物質(キシロース)の添加により制御可能な株を構築した。様々な糖消費速度条件下におけるセルラーゼ生産量を測定した結果、malPが緩やかに発現している場合にMGB874株と比較して約2倍の酵素生産を示した。
3)ユーティリティー機能増強(高生産化技術)
ヌクレアーゼ遺伝子群を欠失した結果、セルラーゼ生産性が野生株に比べて最大1.5倍に向上した。枯草菌のrRNAオペロンの欠失によりセルラーゼ生産性が1.2倍に向上した。さらに、遺伝子削除によるリボソームの改変によっても、セルラーゼ生産性が最大1.2倍に向上した。シャペロン様遺伝子群の集約化と共発現により、ヒト・インターフェロンαの生産性が2倍、インターフェロンβは1.8倍、エンドスタチンは1.2倍にそれぞれ向上した。タンパク質分泌装置を構成するsecAのC末端側に存在する不用領域の削除により、セルラーゼおよびヒト型インターフェロンαの生産性が2倍となった。また、枯草菌の持つ2つのTat分泌システムを、それぞれ高発現した結果、ヒト型インターフェロンαタンパク質の生産性が約2倍向上した。細胞表層の電荷制御技術の構築を目指し、プロテアーゼ9重欠失株(Dpr9)をベースに、細胞壁の電荷(テイクロン酸およびリポテイコ酸)に関与する遺伝子を人為的発現制御できる株を構築した。テイクロン酸高発現株においてセルラーゼ生産量が約1.3倍に向上した。各種細胞膜脂質合成関連遺伝子欠失を10株構築し、セルラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼの生産性を検討した結果、いくつかの欠失株で酵素生産性が向上し、酵素の種類により生産に適した膜脂質組成が異なる可能性が示唆された。
4)ゲノム縮小株への高生産化技術の統合
 種々の統合株を検討した結果、925kbpを削除したゲノム縮小株(RGF925)に、rocG欠失とアンモニア流加培養・secY強化の個別技術を集約した結果、MGB874株に対してセルラーゼ生産性が2.5倍向上し、初期の目標である2倍向上を達成した。
英文要約Title:Development of Basic Technologies for Advanced Production Methods Using Microorganism Functions. High-performance host cell creation technology. “Construction of Refined Genome Factory from Bacillus subtilis.”
Report for FY2006-FY2010
The objective of this research is to create a host microorganism with much higher efficiency for protein production than the present host strain. The construction of refined genome factory (RGF) of Bacillus subtilis has been conducted.
1) Analysis of gene function
A reduced-genome strain (MGB1334) was constructed form B. subtilis MGB874 by deletion of 27 gene regions, which resulted in a 20% increase of cellulase productivity in the later growth phase when compared to MGB874. Another protein expression and evaluation system for lipase (LipA) was constructed. It was confirmed that the lipase production was increased by 1.2 times of the parent strain when the proteases located in the cell surface were deleted.
2) Regulation of specific gene expression
It made the cellulase productivity increased for 1.2 times to gather the protein secretion genes together as a single operon. It is suggested that the expression of glutamic acid metabolic gene rocG play a key role in the nitrogen metabolism of B. subtilis. The rocG deletion strain of MGB874, increased the cellulase productivity by 50% when using ammonia fed-batch culture. Moreover, the cellulase productivity was finally increased by 70% by improving the ammonia metabolic pathway. In addition to the nitrogen metabolism, the carbon metabolism control has also been investigated. By regulating the expression of maltose transporter gene, malP, the cellulase productivity was increased 2 times compared to that of MGB874 strain.
3) Enhancement of utility function
Deletions of nuclease genes and rRNA operons from B. subtilis genome resulted in 50% and 20% increases of cellulase productivities respectively. A 20% increase of celllulase productivity was also observed in the ribosome modification mutant. It was indicated that the productivities of human interferon alpha, interferon beta, endostatin were increased by 100%, 80% and 20% respectively, by expressing the chaperone genes together in a same operon. The same results were obtained for the interferon alpha, by modifying the C-terminal of SecA, one of the secretion proteins and over expressing Tat secretion system genes, respectively. Furthermore, cellulase productivity was increased by 30% by over expressing of teichuronic acid synthesis-related genes on the cell surface of the B. subtilis.
4) Integration of high productivity technology in reduced-genome strain
A final RGF strain was constructed by integrating the over expression of secY and deletion of rocG techniques in the genome reduced strain RGF925, with a 925kbp deletion. As a result, the cellulase productivity was increased by 2.5-fold compared to the parent strain MGB874, when using the ammonia fed-batch culture technique.
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