成果報告書詳細
管理番号20110000000736
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発/微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発/高性能宿主細胞創製技術の開発、微生物反応の多様化・高機能化技術の開発、バイオリファイナリー技術の開発、総合調査研究/放線菌の活用による新規二次代謝産物の開発
公開日2011/6/7
報告書年度2006 - 2010
委託先名明治製菓株式会社
プロジェクト番号P06014
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約(1) 「天然型」抗生物質A生合成遺伝子クラスターの解析 「天然型」抗生物質Aの生合成に関わる遺伝子クラスターの塩基配列(71,079bp)を解析し、決定した塩基配列内に52個のORFが存在することを確認した。この中から「非天然型」抗生物質Bを発酵生産させる上で鍵となるケトレダクターゼ遺伝子を見出し、本遺伝子を破壊することによって「天然型」抗生物質Aの非生産株を作出した。一方、「非天然型」抗生物質Bの生産性に関与すると考えられる糖転移酵素遺伝子についても検索を行い、クラスター内に2種の候補遺伝子を見出したが、遺伝子破壊実験により1種の遺伝子のみが「天然型」抗生物質Aの生合成に関与していることを明らかにした。(2) 「非天然型」抗生物質B生産用遺伝子資源の探索 放線菌が生産する既知二次代謝産物の分子構造を検索し、「非天然型」抗生物質B生産に利用可能なケトレダクターゼ遺伝子として、5種のケトレダクターゼ遺伝子をクローニングした。これらを(1)で取得したケトレダクターゼ遺伝子破壊株に導入して「非天然型」抗生物質Bの生産性を調べた結果、Amycolatopsis orientalis由来のケトレダクターゼ遺伝子が最も優れていることが明らかとなり、ケトレダクターゼの基質特異性が目的物質の生産性に大きく影響することが確認された。そこで、本ケトレダクターゼの基質特異性を目的物質生産に最適化するため、進化工学的手法を用いて優良変異遺伝子のスクリーニングを実施した。その結果、「非天然型」抗生物質Bの生産性を向上させるアミノ酸置換を5種見出すことに成功した。(3) 放線菌による「非天然型」抗生物質の生産検討 (2)に記載の通り、ケトレダクターゼ遺伝子破壊株を宿主としてA. orientalis由来のケトレダクターゼ遺伝子を導入することによって「非天然型」抗生物質Bを発酵生産させることに成功した。更に、変異ケトレダクターゼ遺伝子の利用、導入ケトレダクターゼ遺伝子の染色体上の位置効果及びコピー数増加、「非天然型」抗生物質B生合成遺伝子クラスター全体のコピー数増加等の検討を加えることによって、「非天然型」抗生物質Bの生産性を約50倍に向上させることができた。(4) 二次代謝産物生合成の制御技術の開発 放線菌において普遍的に見られるガンマブチロラクトンによる二次代謝制御について、ストレプトマイシン生産菌を対象にさまざまな「オーム解析」を行い、本菌においてはガンマブチロラクトンによって誘導されるグローバルな転写因子を介した遺伝子発現制御カスケードの全体像を明らかにした。さらに、個々の制御系について詳細な研究を行った。これら一連の研究から、グローバルな制御系あるいは経路特異的制御系の改変による二次代謝産物の増産に関する多くの知見を得ることができた。(5) コンビナトリアル生合成技術の開発 人工生合成遺伝子クラスター法のモデルとして、植物ポリケチドの大腸菌での生産に取り組み、非天然型を含むフラボノイド、スチルベノイド、クルクミノイドの生産系の構築に成功した。さらに、4-ヒドロキシ-3-ニトロソベンズアミド、フェロベルディン、テルペノイドキノンなどの生合成遺伝子クラスターを放線菌より新たにクローニングし、これらの遺伝子クラスターの一部あるいは全部を異種放線菌で発現することで、種々の新規化合物を生産する系を構築した。これらの研究により、コンビナトリアル生合成に関する有用な知見が数多く得られた。
英文要約Title: Development of Basic Technologies for Advanced Production Methods Using Microorganism Functions (FY2006-FY2010) Final Report
(1) (1) The nucleotide sequence (71,080 bp) including the biosynthetic gene cluster was determined and 52 ORFs were identified. A ketoreductase gene identified in the biosynthetic cluster was disrupted in the original strain that produces “antibiotic A”. The disruptant obtained did not produce “antibiotic A”, showing that the ketoreductase plays an essential role in “antibiotic A” biosynthesis. In addition, two glycosyltransferase genes were indentified in the ‘antibiotic A’ biosynthetic gene cluster and only one gene was shown to be essential for the biosynthesis of ‘antibiotic A’. (2) Five different ketoreductase genes were isolated from other antibiotic-producing strains and introduced into the ketoreductase-gene disruptant from the ‘antibiotic A’ producing strain. The production level was varied dependent on the ketoreductase genes used for the transformation experiments and the highest titer was obtained when the ketoreductase gene derived from Amycolatopsis orientalis was used. To improve the ketoreductase gene, the error-prone PCR method was applied to the ketoreductase gene and the mutants showing higher titer than the wild type were screened. Five kinds of amino acid replacement that improved the productivity of the ‘antibiotic B’ were identified. (3) The productivity of the ‘antibiotic B’ was improved about 50 times higher than original level through various methods including the utilization of the ketoreductase variant, the integration site of the ketoreductase gene, and the amplification of all of the gene cluster. (4) Regulation of secondary metabolism by gamma-butyrolactones is common in Streptomyces. Several “ome”-analyses revealed an overall picture of the regulatory cascade of gene expression for secondary metabolism triggered by a gamma-butyrolactone, called A-factor, in a streptomycin-producing strain, Streptomyces griseus. In this regulatory cascade, the A-factor-inducible global transcriptional regulator AdpA activates many genes involved in secondary metabolism. Some individual regulatory systems under the control of AdpA were also characterized in details. These analyses gave us many insights into the improvement of secondary metabolite production in Streptomyces by manipulation of a global or pathway-specific regulatory system. (5) Production of plant-specific polyketides in Escherichia coli was examined as a model study of the “artificial gene cluster method”. As the result, several systems for production of flavonoids, stilbenoids, and curcuminoids (including unnatural polyketides) were developed. Furthermore, several previously undescribed gene clusters for the biosynthesis of some secondary metabolites, including 4-hydroxy-3-nitrosobenzamide, ferroverdin, and a terpenoid-quinone, were cloned and characterized. Several new systems for the production of novel compounds were developed using whole or a part of these gene clusters. These analyses gave us many useful insights into combinatorial biosynthesis.
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