成果報告書詳細
管理番号20110000000765
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発/微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発/高性能宿主細胞創製技術、微生物反応の多様化・高機能化技術/発現タンパク質解析による微生物機能利用のための技術基盤の研究開発
公開日2011/6/7
報告書年度2006 - 2010
委託先名独立行政法人製品評価技術基盤機構
プロジェクト番号P06014
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約資源枯渇やCO2等排出物の環境への影響が懸念されており、環境対応型の化学プロセスからエネルギー負荷の少ないバイオプロセスへ変換する技術の開発が必要とされている。技術開発に貢献するため、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部は、「発現タンパク質解析による微生物機能利用のための技術基盤の研究開発」を実施した。
 網羅的プロテオーム解析は、対象菌株に対して(1)菌体の培養条件、(2)ペプチドマス~フィンガープリント法による網羅的プロテオーム解析、(3)ショットガン法による網羅的プロテオーム解析、(4)エドマン分解法による有機溶媒耐性重要遺伝子の翻訳開始位置の決定、(5)膜タンパク質のプロテオーム解析技術の開発、(6)データ解析及び提供、を実施した。
 高性能宿主細胞創製技術の開発に必要な基盤技術を収集するため、大規模に遺伝子を削除した大腸菌であるDGF株(MGF-01)及びその親株であるEscherichia coli K-12 W3110株を対象として、網羅的プロテオーム解析を実施した。
 実施の結果、E. coli K-12 W3110株の総遺伝子数4,388の37.3%である1,641の発現タンパク質を検出した。MGF-01株のプロテオーム解析の結果、1,385個の発現タンパク質を検出した。MGF-01株に残存している機能未知遺伝子から、368の発現タンパク質が確認され、機能解析対象遺伝子とした。MGF-01株は、対数増殖期が終了したと考えられる状態から、定常期に移らず、更に増殖する傾向が見られた。代謝を解析したところ、代謝が変化しており、TCAサイクル等のエネルギー供給系の増強が確認された。
 非水系バイオプロセスを実現するため、有機溶媒耐性菌Rhodococcus opacus B-4株(R. opacus B-4)及びKocuria rhizophila DC2201株(K. rhizophila DC2201)を対象として、網羅的プロテオーム解析を実施した。
 実施の結果、R. opacus B-4の有機溶媒耐性株と有機溶媒耐性劣化株が得られ、両株のデータを比較した。有機溶媒耐性株からは、総遺伝子数8,366の23.5%である1,962の発現タンパク質を検出した。有機溶媒耐性劣化株からは、2,521の発現タンパク質を検出した。代謝を解析したところ、有機溶媒耐性株は特にmycolyltransferaseを多量に発現させ、特殊な細胞膜構造を構築しているものと考えられた。また、有機溶媒耐性劣化株は、膜構造が未完成であるため、環境対応タンパク質を多く発現しているものと考えられた。
 K. rhizophila DC2201の有機溶媒接触株と非接触株の両株のデータを比較した。非接触株からは、総遺伝子数2,356の47.5%である1,118の発現タンパク質を検出した。有機溶媒接触からは、972のタンパク質を検出した。代謝を解析したところ、両株ともに発現タンパク質の差は少なかった。有機溶媒接触株は、排出ポンプに関係する遺伝子の発現があるが、その他のほとんどが機能未知発現タンパク質であった。有機溶媒耐性機構としては、近縁種が得ている耐薬品性の性質と類似し、分泌タンパク質が関係していると考えられた。
 解析結果から、R. opacus B-4株は、生体触媒として利用する方法、K. rhizophila DC2201株は、生体触媒及び二層系培養にも実施可能であると考えられる。
 網羅的プロテオーム解析結果は、共同研究先に提供し、解析が進められている。
英文要約   National Institute of Technology and Evaluation (NITE) conducted comprehensive proteome analysis of three microorganisms which are studied in this project as potential host organisms for bioprocesses.
   In the sub-project "the development of high-performance host cell creation methods", we analyzed Escherichia coli MGF-01, one of the DGF (Designed Genome Factory) strains with massively reduced genome size, and its parental strain W3110. Comprehensive proteome analysis identified expression of 1,385 and 1,641 proteins from MGF-01 and W3110 cells, respectively, corresponding to 37.3% of a total of 4,388 predicted proteins in the latter case. Of the 1,385 proteins identified in MGF-01, 368 were from genes of unknown function, which were regarded as candidates for functional analysis in the project. After logarithmic growth phase, the MGF-01 strain seemed to escape from entry into the stationary phase and continue to grow further, resulting in higher cell density. Metabolic analysis based on proteome data revealed that the supply of energy and C4 to C6 substrates through the glycolysis and TCA cycle was enhanced in MGF-01 under this growth condition.
   In the sub-project "the development of methods to diversify functions and improve the performance of microbial processes", we analyzed two organic-solvent tolerant bacteria, Rhodococcus opacus B-4 and Kocuria rhizophila DC2201, to contribute to the development of bioprocesses in non-aquatic conditions. Comprehensive proteome analysis of R. opacus B-4 identified expression of 1,962 proteins, corresponding to 23.5% of a total of 8,366 predicted proteins.
   In the course of this study, a culture with reduced tolerance to organic solvent such as toluene was obtained. We identified expression of 2,521 proteins in this culture.
In comparison with this culture, the original culture expresses much larger amount of mycolyltransferases, suggesting that the integrity of the cell surface structure including mycolic acid plays important role in the tolerance to organic solvent. The culture with reduced tolerance may express larger number of stress-response proteins due to the immature cell surface which makes the cell more sensitive to toxic organic solvent.
   Comprehensive proteome analysis of K. rhizophila DC2201 identified expression of 1,118 and 972 proteins in the absence and presence of organic solvent, respectively. The former corresponds to 47.5% of a total of 2,356 predicted proteins. The overall proteome patterns are very similar between these culture conditions, suggesting that most of the cellular proteins are retained even in the presence of organic solvent. Most of the genes expressed at higher level in the presence of organic solvent were of unknown function with the exception of genes related to drug export. The active excretion of toxic organic solvent, in addition to the high integrity of cell structure, may contribute to the tolerance of this bacterium to organic solvent.
ダウンロード成果報告書データベース(ユーザ登録必須)から、ダウンロードしてください。

▲トップに戻る