成果報告書詳細
管理番号20110000000804
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 高機能簡易型有害性評価手法の開発 培養細胞を用いた有害性評価手法の開発 発光プローブと発光細胞の開発
公開日2011/7/28
報告書年度2006 - 2010
委託先名東洋紡績株式会社
プロジェクト番号P06040
部署名環境部
和文要約化学物質のリスク評価においては、一般的に細菌等を用いた簡便な試験や動物を用いた長期間の毒性試験によって有害性情報を取得しているが、このような簡易試験で得られる情報の種類は限られており、また長期毒性試験についてはその費用や効率が課題として指摘されている。これらの結果を補う手法として培養細胞を用いた手法が注目されている。
 東洋紡績株式会社は、(独)産業技術総合研究所(以下産総研と省略)と共同開発した赤、橙、緑色の発光を放つ多色発光ルシフェラーゼを用いた細胞アッセイ技術を基盤に、本プロジェクトにおいて、産総研と連携しながら、基盤技術という側面から発がん・催奇毒性・免疫毒性を評価する手法の開発に寄与した。開発事項は以下の通りである。1つ目に、発光プローブの開発を行った。まず、ルシフェラーゼ遺伝子と安定導入のための薬剤耐性遺伝子発現カセットを搭載した毒性評価細胞構築のための発光ベクター(pSLG-test/Hyg、pSLO-test/Neo、pSLR-test/Pur)を作製した。また、短寿命化プローブ、赤色発光プローブの高発光化などにも取り組んだ。2つ目に、実際に、毒性評価細胞に組み込む発光プローブの開発を行った。我々は、国立大学法人東北大学病院と連携して、主に免疫毒性を対象として、IFNγ、IL4、IL2、IL1β、IL8遺伝子などのマーカー遺伝子のプロモーターをクローニングし、免疫毒性評価細胞に最適化した発光プローブの開発を行った。さらに、開発した発光プローブをJurkat細胞やU937細胞に安定導入して発光細胞の開発を行い、Jurkat:IL4-SLG/IFNγ-SLO/G3PDH -SLR、Jurkat:IL2-SLG/IFNγ-SLO/G3PDH-SLR、U937:IL1β-SLG/IL8-SLO/G3PDH -SLRなど、多色発光機能を組み込んだ毒性評価細胞発光技術の開発を行った。これらの作業と平行して、免疫毒性評価細胞の培養方法の検討、試験方法の検討、樹立した細胞の継代安定性の検証などを進めた。最終的に、本プロジェクトで開発した多色細胞を用いた施設間差試験を行い、本プロジェクトにおいて開発された細胞、アッセイ方法によって、免疫毒性を持った化合物を簡便に、再現性よく、評価できることを確認した。
英文要約In risk assessment of chemical compounds, hazardous information has been generally acquired from simple test using bacteria and long-term animal toxicity testing. However, types of information from such simple tests are limited, and for the long-term testing, the cost and efficiency are pointed out as issues. To make us for this disadvantage, the assessment method using cultured cells is drawing attention. We have contributed to development of assessment method of carcinogenicity, immunotoxicity, and developmental toxicity, on the basis of cell-based assay technology using tri-colored (red, orange, and green-light emitting) luciferase system, in close coordination with Dr. Ohmiya, et al., National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. The following items have been mainly examined. Firstly, light-emitting probe plasmid vector have developed. Vectors including a light-emitting probe and an antibiotic resistance gene (pSLG-test/Hyg, pSLO-test/Neo, and pSLR-test/Pur) have been constructed. The probe with reduced intracellular lifetime and the enhanced red light-emitting luciferase have developed. Secondly, the probes transfected into cultured cells for hazardous assessment have been developed. We have developed them specifically focused on immunotoxicity in coordination with Dr. Aiba, Tohoku University. The promoters of candidate of marker genes such as IFN gamma, IL4, IL2, IL1beta, and IL8 were cloned and the probes optimized for immunotoxicity assessment cells were constructed. Multi-colored light-emitting cells have been developed by stably transfecting the probes into Jurkat cells or U937 cells and Jurkat : IL4-SLG/IFN gamma-SLO/G3PDH-SLR, Jurkat : IL2-SLG/IFN gamma-SLO/G3PDH-SLR, U937 : IL1beta-SLG/IL8-SLO/G3PDH-SLR , and other cells have been established. The method of culturing and assaying the immunotoxicity assessment cells, and signal stability of them in high-passage cultures have been also verified. Finally, intergroup pre-validation studies using the established multi-colored light-emitting cells were performed.
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