成果報告書詳細
管理番号20110000000806
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 高機能簡易型有害性評価手法の開発 培養細胞を用いた有害性評価手法の開発 ハイスループット発がん性予測試験法の開発(H18~H22)
公開日2011/7/28
報告書年度2006 - 2010
委託先名財団法人食品薬品安全センター
プロジェクト番号P06040
部署名環境部
和文要約1. Bhas 42細胞を用いた発がん性予測試験法の能力と有効性の研究
1-1. Bhas 42細胞形質転換試験のパフォーマンスと特性
Bhas 42細胞形質転換試験のプロトコールを整備し、このプロトコールに従ってインハウスで98物質を試験した。その結果とin vivoにおける発がん性との比較から、Bhas 42細胞形質転換試験は、従来の遺伝毒性試験と等しいかそれよりも優れたパフォーマンスを有していることが明らかになった。また、代表的な遺伝毒性試験であるAmes試験で検出できない(あるいは検出しにくい)物質を相当数検出することができる試験であることが証明された。
1-2. 96-ウェル法の開発
Bhas 42細胞形質転換試験は、従来6-ウェルプレートを用いて行われてきた(6-ウェル法)が、自動化に適した96-ウェルプレートを用いる方法(96-ウェル法)を新たに開発した。96-ウェル法で6-ウェル法と同じ試験結果が得られることを確認した。
1-3. 国際バリデーション
Bhas 42細胞形質転換試験がガイドラインとして採用されるためには、多施設によるバリデーションが必須である。Bhas 42細胞形質転換試験の6ウェル法でのバリデーションは、海外の2施設を含め全体で8施設の協力を得て、17化学物質(のべ21物質)を対象として実施した。一方、96ウェル法での国際バリデーションは、4施設の協力を得て、22化学物質(のべ25物質)を対象に、実施した。被験物質の総計は、22物質(のべ46物質)となった。バリデーションでは、VMT-Meetingを開催して、試験結果を評価し、試験法の妥当性、再現性並びにデータの統計解析やプロトコールの一部変更などを討議した。
1-4. ガイドライン化への提案
Bhas 42細胞形質転換試験OECDガイドライン化に向けて、Standard Project Submission Form (SPSF:提案書)を平成22年1月末に経産省を通してOECDへ提出した。さらに、同年3月23~25日に開催された第22回OECD, WNT会議において提案理由の説明を行い、ガイドライン化に向けて作業を進めることが了承された。ピュアレビュー開催に向け、各種資料作成を進めた。
1-5. Bhas 42細胞の性状解析
Bhas 42細胞は、JCRB細胞バンクに登録済みで、通常の性状はすでに明らかになっている。しかし、Bhas 42細胞形質転換試験をOECDガイドライン化するには、特に遺伝子操作で導入したv-Ha-rasについての情報が必要である。これを得るために必要な解析を進めた。v-Ha-ras遺伝子を保有している細胞の割合は100%であり、コピー数は平均2.4個、v-Ha-rasの発現は1週間に1回の継代で少なくとも4週間は、安定であった。形質転換によって、軟寒天コロニー形成率、v-Ha-rasの発現は、ほとんどの細胞で増加した。
2. Bhas 42細胞を用いた発がん性予測試験法のハイスループット化
2-1. 96ウェル法の自動化装置開発
Bhas 42細胞形質転換試験を自動で実施する装置を開発した。連続吸引、ドラフト機能付加、チップの完全嵌合、プログラムの単純化など操作性の向上に努めた。装置を用いて形質転換試験を実施し、手作業で行った時と同様の結果が得られることを確認した。
2-2. 形質転換率測定のための比色法の開発
低濃度の過酸化水素処理によって形質転換細胞を選択的に生存させることが可能であることを見いだし、生存細胞測定試薬WST-8を利用した形質転換率の比色定量法、「過酸化水素~WST-8法」を開発した。
2-3. 発光Bhas 42細胞を用いた簡便な試験法の開発
Bhas 42細胞の形質転換をより短時間で検出するため、形質転換物質に応答して発光する細胞を開発した。Bhas 42細胞の形質転換に関わる遺伝子として得られた13候補遺伝子のうち、形質転換物質による発現増加量からMmp10を選定し、発光レポーターBhas 42細胞(Mmp10-SLG/β-actin-SLR)を産総研で樹立した。アッセイ系の最適化、発光細胞のphenotype(形質転換能等)の検査を行った。
英文要約1. Performance and validation of Bhas 42 cell transformation assay for the prediction of chemical carcinogenicity
Bhas 42 cell transformation assay has been characterized and validated to be compiled into the OECD guideline.
1-1. Performance and characteristics of Bhas 42 cell transformation assay
The Bhas 42 cell transformation assay was applied to 98 chemicals in-house and its performance to predict carcinogenicity was shown to be superior or equal to that of the conventional genotoxicity tests. The Bhas 42 cell transformation assay was demonstrated to be able to detect a considerable number of Ames-negative and Ames-discordant carcinogens.
1-2. Development of a 96-well method
The Bhas 42 cell transformation assay has been carried out using 6-well micro-plates (6-well method). In addition, we have developed a method using 96-well micro-plates (96-well method) that has the potential to be utilized for high throughput automated applications. The 96-well method was confirmed to be equal to the 6-well method in the ability to predict the chemical carcinogenicity.
1-3. Validation studies
To validate the Bhas 42 cell transformation assay (6-well method), “pre-validation study”and “validation study” were performed. Eight laboratories participated from Japan, Germany and USA, and 17 chemicals (a total of 21 chemicals including duplicate chemicals) were tested.
The validation study of 96-well method was forwarded stepwise (pre-validation phase, phase I and phase II), 4 laboratories participated and 22 chemicals (a total of 25 chemicals including duplicate chemicals) were tested. All the test chemicals were coded until completion of data submission. A Validation Management Team (VMT) including members from ECVAM, ICCVAM and JaCVAM was organized to direct the validation studies. The validation studies proved that the 6-well and 96-well methods are transferable between laboratories, reproducible both within and between laboratories, and applicable to the prediction of chemical carcinogenicity.
1-4. OECD test guideline
At the end of January in 2010, the Standard Project Submission Form (SPSF) of Bhas 42 cell transformation assay was submitted to the OECD secretariat via METI. The proposal reason was explained in the WNT (Working Group of National Coordinator for Test Guideline) Meeting in March, 2010.
1-5. Characterization of Bhas 42 cells for the v-Ha-ras gene
The Bhas 42 cells in the current population were examined for the ras gene transfected.
One-hundred percent of the Bhas 42 cells retained ras at the average of 2.4 genes/cell.
The expression of mRNA was stable during 4 passages for 4 weeks.
2. Development of high-throughput methods
2-1. Development of an automated apparatus for the Bhas 42 cell transformation assay
We developed an automatic toxicity test system equipped with a liquid handling unit in a clean bench. The system was confirmed to give assay results similar to the conventional manual procedures.
2-2. Development of colorimetry for cell transformation
A colorimetric method was developed to measure transformed cells, based on the discovery that the transformed cells can survive treatment with diluted hydrogen peroxide.
2-3. Development of reporter-gene assay
To shorten the assay period of cell transformation, the light-emission Bhas 42 cells which respond to transformation-active substances were developed. Mmp10 was selected out of 13 marker gene candidates, set in the reporter construct (Mmp10-SLG/β-actin-SLR), and introduced into Bhas 42 cells.
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