成果報告書詳細
管理番号20110000000832
タイトル平成22年度成果報告書 高機能簡易型有害性評価手法の開発 培養細胞を用いた有害性評価手法の開発 高機能毒性予測試験法基盤技術の開発(H18~H22)
公開日2011/7/28
報告書年度2010 - 2010
委託先名独立行政法人産業技術総合研究所
プロジェクト番号P06040
部署名環境部
和文要約(1)多色発光細胞の時系列測定技術の開発
【研究開発の内容】
免疫毒性評価用および発がん評価用に選定した遺伝子について多色発光プローブの開発を進め、評価用発光細胞を製作する。さらにすべての予測試験法について東洋紡績と連携し基盤技術部分のプロトコール作成を支援するとともに、発光測定を高精度化するための標準発光物質を製作、発光特性を値付けした標品の供給法を確立する。
【研究開発の成果等】
1)発光プローブ改良および高機能化、カルパインの部分配列を用いた短寿命化に成功、また生細胞での発光強度が向上した赤色ルシフェラーゼ変異体、及び細胞破砕液中においてもより安定な赤色ルシフェラーゼの変異体をそれぞれ確保した。
2)免疫毒性評価細胞U937ではIL-8とIL-1βの発光活性を、またJurkat細胞ではIL-2とIFNγを指標とした3色発光免疫毒性評価細胞の安定発現株を確立した。またこれら細胞株の培養・継代・ストック法の最適化を東洋紡と共に検討した。
3)Bhas 42細胞を用いた短期発がんリスク評価のため、食薬センターと連携しMmp10遺伝子およびβ-actin遺伝子の発現を同時に観察する多色発光細胞の取得に成功した。
4)発光測定を高精度化するための多色発光ルシフェラーゼ標準品を作成し、それらを長時間安定に保持できる条件を決定、また標準品の大量生産を実施、発光特性の値付けを行った。
(2)細胞内遺伝子発現シミュレーション技術の開発
【研究開発の内容】
情報科学的な手法により形質転換時に特異的に発現量が変動する遺伝子を特定し、発がんマーカーとなる候補遺伝子を抽出する。
【研究開発の成果等】
食薬センターにおいて得られたBhas42細胞の形質転換に伴う遺伝子群の中から、情報科学的な手法により形質転換に関与する遺伝子群を35種同定した。
(3)細胞培養複合技術の開発
【研究開発の内容】
化学物質の代謝吸収に関与する細胞との組織複合培養により生体への外挿性を向上させるための研究開発を行う。
【研究開発の成果等】
S9分画のマイクロカプセル化とそれを基礎とした複合培養法により,細胞ベースの様々な代替試験法に簡単に肝代謝能を組み込むことができるという高い汎用性と実用性とを持つ手法の開発に成功した。
(4) ヒト人工染色体ベクターを用いたモニター遺伝子導入システムの開発
【研究開発の内容】
評価用発光細胞の製作に関して、ヒト人工染色体(HAC)ベクターを用いた技術の有効性を従来の安定発現細胞作製技術と比較して検証する。実際に免疫毒性や催奇形性に関する評価用発光細胞を新技術によって作製する。特に、バリデーションを進める為に重要な課題であるクローン間のばらつきや長期培養における品質の維持に関する検定の準備を行う。
【研究開発の成果等】
1)HACベクターを用いた複数遺伝子導入システムの検証
複数種類の部位特異的組み換え酵素を用いた遺伝子導入システムの検証を進めて、複数の特定部位に遺伝子を効率よく導入出来ることを検証した。また、従来法で作製した細胞よりも導入遺伝子が安定に発現することを明らかにした。
2)HACベクターを用いた評価用発光細胞の作製
免疫毒性評価用プローブIL1β/SLG(緑色発光)をCHO細胞中のHACベクターに導入した。さらに微小核融合法によりU937細胞に構築したHACベクターを移入して、免疫毒性評価用細胞を複数クローン構築した。構築したクローンからランダムに選択した4クローンを用いて化合物の応答性に関する試験をしたところ、全て同様の反応の反応を示した。この事から、HACを用いたシステムではクローナルバリエーションが少ないという従来法との優位性を実証した。
英文要約We must be screening a harmful compound from among the chemicals invented every day for the sake of quality of life. Recently, the screening system of the cell base is paid to attention instead of using the screening system of animal base. For the final purpose of this project, we will be creating a high-performed prediction system for the toxicity of harmful chemicals on the cell base assay using multiple bioluminescence probes. Our bioluminescence probes using beetle luciferases that emit various colors with a luciferin can observe the dynamics of three gene expressions in the cells. Namely, our tricolor reporter in vitro assay system in which three gene expressions are monitored simultaneously using green-, orange- and red-emitting beetle luciferases for chemical toxicity. In this project, we have performed the basis of prediction system for immunotoxicity in collaboration with AIST, TOYOBO Co., Tohoku University and Tottori University, and for cancer-toxicity in collaboration with Food and Safety Center, Hatano Research Institute, AIST and The University of Tokyo. Furthermore, human artificial chromosome (HAC) technology that has been originally developed by Tottori University was applied to construct the reporter cell lines for monitoring immmunotoxicity. Recently, Tottori group newly developed a gene modification system (a 'multi-integration' system), which utilizes distinct multiple integrases from phages and their unique target sequences. The applications of this system include the ability to stably introduce multiple genes into cells. Our results were as follows;
1) AIST group performed construction of the immunotoxicological and cancer-toxicological cell-base assay using tricolor reporter. We established several tricolor reporter assay cell lines; INF-γ and IL-2 in Jurkat cell, IL-8 and IL-1β in U937 cell, and Mmp10 and β-actin in Bhas42 cells. These cell lines could estimate the immuno- and cancer-toxicities of chemicals. Furthermore, we established the standardization method of tricolor reporter assay using characterized color difference luciferases and commercial luminometer.
2) By means of bio-informatics method, we have identified 35 genes that display transcriptional change associated with transformation of the Bhas 42 cells.
3) We have successfully developed complex culture system in which the S9 liver fraction was incorporated into microcapsule.
4) We have established the monitor cells expressing the green- and red-emitting luciferases for immunotoxicity using the HAC vector system. The expression of the probes increased by treatment with PMA, which activate T cells. Unlike the random gene integration in the genome of conventional monitor cells, the HAC vector was stably maintained episomally, thus circumventing issues such as position effects on gene expression.
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