成果報告書詳細
管理番号20110000000891
タイトル平成22年度成果報告書 高機能簡易型有害性評価手法の開発 培養細胞を用いた有害性評価手法の開発 催奇形性予測試験法の開発(H18~H22)
公開日2011/7/28
報告書年度2010 - 2010
委託先名住友化学株式会社
プロジェクト番号P06040
部署名環境部
和文要約化学物質の総合的なリスク評価管理の基礎データとなる有害性評価において、培養細胞を用いた手法が注目されており、近年急速に発展してきた生命科学の手法と組み合わせることによって、短期間で精度よく効率的に有害性情報を取得する簡便な試験系を実現できる可能性が開けている。本プロジェクトでは、遺伝子導入、幹細胞分化誘導、遺伝子発現等の技術を培養細胞に活用し、高機能で簡易な有害性手法を開発することを目的としている。具体的には、マウスES細胞を用いた催奇形性に適した心筋、神経、筋・骨格系の各々へ分化する試験手法を確立し、10物質程度の催奇形性物質を用いて、催奇形性に関与している遺伝子を、細胞の変化と遺伝子発現との関係を時系列的に測定解析して、同定する。同定した遺伝子に発光する機能を組み込んだ細胞を開発し、1ヶ月以内の試験期間で催奇形性を検出する試験法を開発する。確認試験の結果を基に、OECDテストガイドライン化に向けた課題を整理し、対応策を策定する。更に、学校法人鎌倉女子大への再委託により、ラット胎児培養法にラットの代謝酵素を組み合わせ、代謝による被験物質の変化を考慮した試験法を既知のin vitro試験のデータとの比較を行いながら開発する。その後ヒト代謝酵素を添加した系での試験方法の開発を行う。
 上記の目的を達成するための平成18から22年度までの事業内容は以下のとおりであり、項目別にその結果を記載した。
(1) ES細胞を用いた催奇形性予測試験法の開発
 マウスES細胞を用いて心筋、神経および骨格筋への分化誘導法を最適化した。次に動物試験において発生毒性が既知の12物質を用いて、発生毒性陽性物質特異的に影響を受ける遺伝子を、ES細胞の分化過程中の遺伝子発現変動を測定して絞り込んだ。その結果、発生毒性に関連するマーカーとして心筋分化過程でHand1、Cmya1遺伝子を含む13種、神経分化過程で22種を同定した。次にこれらのマーカー遺伝子について、レポータージーンを利用して発現量を簡便に評価することが出来る発光細胞(Hand1-ES等)を作製した。次に作製した発光細胞を利用した発生毒性試験基本プロトコールを作成し、複数の陽性および陰性化合物を用いて発生毒性の評価を行った。既存EST法の国際検証試験で評価された24化合物について検討した結果、既存ESTと同等以上の予測率となった。既存ESTよりも短期間(約1週間)に多数化合物を一度に評価可能な方法となった。さらに多数の化合物を用いて有用性の検討も行い有用性を検討した。神経分化過程においても、評価用発光細胞1株を作成した。また、Hand1-ES等を利用した試験については、4つの機関で共通の化学物質を評価し、試験法の施設間差の確認実験を行い再現性の高い方法であることがわかった。さらにテストガイドライン化の提案に不可欠な評価用発光細胞の性状解析(マイコプラズマ汚染検査等)を行った。また、ヒトES細胞を用いた検討を行い、マウスES細胞で選定したマーカー遺伝子群について、ヒトESの分化過程での発現を解析し有用性を検討した。
(2) 代謝を組み合わせた催奇形性予測試験法の開発
 ラット胎児培養法にラットの代謝酵素S9-mixを組み合わせた培養条件を決定した。In vivoで代謝による活性化が知られている10種の化合物を用いて、S9-mixの有無による胎児への影響を検討した。その結果、全ての化合物でS9-mix添加条件で胎児への影響が増強することが分かった。さらに既存の培養装置を改良し、培養に必要なラット血清量を半減することに成功した。また、さらに培養装置の改良化を行い多数の胎児を一度に培養可能な装置を開発した。
英文要約The aim of this project is to develop a novel in vitro short-term test for reproductive and teratological toxicity using mouse embryonic stem cells (ES cells). We have obtained 13 and 22 marker genes for prediction of embryotoxicity during cardiomyocyte and neural cell differentiation, respectively. We have developed four stable transgenic ES cells with the luciferase reporter gene to detect the chemical dependent changes in the Hand1, Smyd1, Cmya1 and Reln genes easily and conveniently. These cells were named as Hand1-ES, Smyd1-ES, Cmya1-ES and Reln-ES, respectively. In established Hand1-ES, Smyd1-ES, Cmya1-ES cells, changes in each gene expression were coincident with those in luciferase activities during the cardiomyocyte differentiation, suggesting that Hand1, Cmya1 and Smyd1 gene expression could be monitored easily by chemiluminescent determination. In established Reln-ES cells, changes in each gene expression were coincident with those in luciferase activities during the neural cell differentiation, suggesting that Reln gene expression could be monitored easily by chemiluminescent determination. In order to establish appropriate basic operating protocol for in vitro short-term assay for prediction of embryotoxicity, we optimized the assay method about various conditions. In the novel test with the transgenic ES cells, differentiation toxicity and cytotoxicity of test chemicals were analyzed using the ES cells and 3T3 fibroblasts by chemiluminescent determination in 96 micro-well plates for 6 days. Extensive investigations were performed to explore the predictive power and validity of the novel ESTs by applying and comparing a set of 24 well-known test chemicals. The novel ESTs offered the high predictability and accuracy with the reduced test duration and manpower compared to the original EST protocol, indicating new proposal of the rapid and sensitive in vitro method for screening embryotoxicants. : We tried to develop a novel whole embryo culture method with metabolic activation of chemicals using S9-mix of rat. At first, imipramine was incubated with S-9mix in culture solution, and desipramine, which is known as a main metabolite of impramine, was detected, showing metabolic activity of the S-9mix in the present test condition. The effects of several standard chemicals on the growth of cultured embryos were examined with or without S-9mix. The S-9 mix addition caused enhancing or reducing effects on the growth of cultured embryos, suggesting efficacy of the S-9mix in the present method. We developed new equipments to culture 24 embryos in the whole embryo culture method. In order to define appropriate condition for the embryo growth in this equipment, we optimized the assay method about various conditions. Then, basic condition was determined for the embryo growth in this equipment using the 24-well plates. The novel equipment offered the high throughput with the reduced serum volume for growth of embryo culture compared to the classical equipment, indicating new proposal of the rapid method for screening embryotoxicants.
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