成果報告書詳細
管理番号20110000001226
タイトル平成20年度~平成22年度成果報告書 知的基盤創成・利用促進研究開発事業 知的基盤研究開発事業 DNAチップの互換性向上のためのSIトレーサブルな核酸標準物質作製・評価技術の研究開発
公開日2011/7/28
報告書年度2008 - 2010
委託先名独立行政法人産業技術総合研究所 財団法人バイオインダストリー協会
プロジェクト番号P98049
部署名技術開発推進部
和文要約本事業では、DNAチップ(DNAマイクロアレイ)の互換性の向上に不可欠な課題のひとつである、測定の基盤となる核酸標準物質の作製・評価技術を確立することを目的に、以下の5つの課題に関して検討を進めた。
 課題1「核酸の一次標準測定法(SIトレーサブルな核酸の計測方法)の確立」では、核酸物質(DNA、RNA)の一次標準測定法(SIトレーサブルな計測技術)を確立するための技術的検討を行った。同位体希釈質量分析法と分子内のリン定量による方法の二つのアプローチについて検討した。同位体希釈質量分析法については、DNAおよびRNAについて、LC/MSを用いてそれぞれの単量体を精密かつ高感度に分離分析できる測定系を確立するとともに、候補標準DNAを完全に単量体に分解する酵素分解反応条件を決定した。リン定量による方法については、誘導結合プラズマ(ICP)発光分析法を用いる核酸定量法について、微少量導入ネブライザー等を用いた高感度化を進め、試料量50マイクロリットル程度での測定が可能であることが示された。
 課題2「核酸認証標準物質の製造法、純度検定法、安定性、保存方法の確立」では、核酸物質の認証標準物質としての頒布を想定し、DNAおよびRNAの製造法や、その純度および安定性を評価するための各種技術を開発した。さらに、これらを大量合成・高純度精製するための方法を確立すると共に、認証標準物質評価に必要とされる、目的の配列を有する核酸分子の均質性評価方法及び長期安定性に関する評価方法を開発した。
 課題3「核酸標準物質の候補配列のリスト、ライブラリ化」では、DNAチップの互換性の向上に必要な候補標準物質を、連携機関であるJMAC(バイオチップコンソーシアム)などとの連携により選定した。また、候補配列(>70種類)のプラスミドライブラリ化を行った。
 課題4「核酸認証標準物質の開発と頒布体制の構築」においては、上記課題による成果を基に、配列や性状など候補標準物質の仕様を決定し、確立した技術から値付け方法及び均質性評価、安定性評価技術を選定して、4種のDNA認証標準物質認証プロトコル、1種のRNA認証標準物質認証プロトコルを決定した。また、その頒布体制の構築を行った。
 課題5「DNAチップ用核酸標準物質研究開発委員会の開催」では、外部委員を交えた研究開発委員会を開催した(年2回開催)。本課題においては、核酸標準物質のユーザーとなり得るDNAチップ製造メーカー、DNAチップのユーザー、DNAチップを利用した検査、分析業務を行う会社等を外部委員としてお招きし、本事業の進捗状況を評価すると共に、開発される標準物質に必要とされる性能、品質等に関する助言を受け、標準物質の開発研究に情報をフィードバックした。
英文要約DNA chip (DNA microarray) platforms are widely used in many molecular biological diagnostics based upon nucleic acid sequences. Although applicable fields of the DNA chip platforms are expanding at an encouraging rate, traceability of a reference material in this area has not yet been established, making the measurement results not comparable among different DNA chip platforms available in market. In order to guarantee measurement traceability in DNA chip-based measurement, this program intended to conduct the following five projects in parallel; (1) the development of reliable analytical methods for SI-traceable measurement of nucleic acids, (2) the development of protocols for the preparation and evaluation of DNA and RNA (certified) reference materials, (3) the construction of a nucleic acid sequence library for reference materials of DNA chip-based measurement, (4) the development of (certified) reference materials of DNA and RNA, and (5) the coordination of technical committee meetings for facilitating the program. Throughout the period of FY2008-FY2010, the project (1) was conducted to establish analytical methods for nucleic acids (DNA and RNA) with isotope dilution mass spectrometry (ID-MS), inductively coupled plasma (ICP) optical emission spectrometry (ICP-OES), and ICP-mass spectrometry (ICP-MS). The project (2) was conducted to establish methods for making and evaluating DNA reference materials (100 to 600 bp) and RNA reference materials (100 to 530 bases). Large-scale preparations of the DNA and RNA materials were performed, and the short- and long-term stabilities of the DNA and RNA materials were evaluated. The project (3) was performed to establish a list for candidate reference materials to be prepared for DNA chip-based measurement. In collaboration with JMAC (an industry-level consortium, Japan microarray consortium) and other organizations associated with the DNA chip industry, various DNA and RNA sequences were considered as candidate reference sequences. In addition, >70 candidate reference sequences were prepared as plasmid DNAs. The project (4) was conducted to make and evaluate certified DNA and RNA reference materials made in the project (2). The purity of the reference materials was evaluated by various molecular techniques, such as gel electrophoresis, cloning and sequencing, quantitative PCR, and liquid chromatography. In the project (5), technical committee meetings were held twice a year, exchanging opinions of experts from relevant industry and Universities on the goals and progress of the program.
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