成果報告書詳細
管理番号20110000001099
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 高機能簡易型有害性評価手法の開発 培養細胞を用いた有害性評価手法の開発 免疫毒性予測試験法の開発
公開日2011/9/28
報告書年度2006 - 2010
委託先名国立大学法人東北大学病院
プロジェクト番号P06040
部署名環境部
和文要約本研究開発においては、まず、化学物質が免疫担当細胞に与えるストレスの指標となりうる遺伝子をtoxicogenomicsにより抽出し、次に、その遺伝子のプロモーター支配下に発光蛋白を発現する免疫毒性評価細胞を樹立した。更に、それらの細胞を用いて免疫毒性評価系を確立した。 (1)免疫毒性評価遺伝子の同定 接触皮膚炎を惹起する化学物質(dinitrochlorobenzen, NiCl2)、ジーゼルエンジン排気微粒子、フォルマリン、メチル水銀などの環境汚染物質をT細胞,樹状細胞、および上皮細胞に作用させ、誘導される遺伝子をDNA microarray,Bioinformaticsの手法を用いて解析した。その結果、5種類の化学物質の内、3種類以上の化学物質刺激に共通して変動する免疫関連遺伝子として、樹状細胞においては、IL-1α、 IL-1β、 IL-8など5遺伝子、表皮細胞に関してはaldo-ketoreductase1、 heme oxygenase-1 (HMOX1)など5遺伝子、また、T細胞に関してはHMOX1, GADD45Aなど5遺伝子 が同定された。また、その結果は、定量的real-time PCRによって確認された。 (2)発光ベクターの構築 選択した免疫毒性評価遺伝子の中から、HMOX1、 IL-1α、 IFN-γ、 IL-4、 IL-2、 IL-1β、 IL-8遺伝子を選択し、それらの転写調節領域をクローニングし、 緑色(SLG)、橙色(SLO)、赤色(SLR)に発光するルシフェラーゼ発現ベクターに組み込み発光プローブを作成した。 (3)発光細胞の樹立 作成した発光プローブを表皮細胞培養株HaCaT、単球由来細胞株U937およびTHP-1、T細胞培養株Jurkatに遺伝子導入し20種類の発光細胞を樹立した。その中で、以下の6種類の細胞に関して性状解析、有用性の検討を行った。 (4)免疫毒性評価系の確立  IL-8レポーター細胞,THP-G8に関しては、これを利用した接触皮膚炎感作性試験代替法への応用を検討し、抗酸化物質であるN-acetylcyteineによる抑制効果を加味し評価基準を作成しIL-8 Luc assayを確立した。このアッセイ法を用いて約30種類の化学物質を評価したところ80%を上回る精度が得られ、現在ECVAMなどでvalidationが行われている代表的感作試験代替法と比較して遜色のないものであった。  また、IL-2/IFN-γレポーター細胞2H4とIL-1β/IL-8レポーター細胞6C12を用いては、化学物質免疫毒性の多因子評価系を確立した(Multi-Immunotox assay)。この方法により、デキサメサゾン、シクロスポリンなどの免疫抑制剤を評価すると、それらのT細胞、樹状細胞への作用メカニズムの相違が容易に評価できた。  HMOX1に関するレポーター細胞UR38H6に関しては、活性酸素産生、酸化還元バランス、ER ストレスなど細胞にストレスを与える化学物質のスクリーニング系としての有用性が明らかになった。 (5) 結語  当初の予定通り免疫毒性評価に必要なバイオマーカーを決定し、それらを用いて免疫毒性評価に有用と思われる発光細胞を約10種類樹立することができた。また、それらの細胞を用いて、接触皮膚炎感作性試験,免疫毒性多因子評価系,細胞ストレス評価系を確立した。化学物質であふれる現代社会において、化学物質の免疫毒性を科学的根拠に基づき評価する新たな方法を確立することができた。
英文要約The final goal of our project is to develop a cell-based high throughput screening system to detect immunotoxicity of chemicals. (1) Selection of target genes To discover the common response patterns which are shared by immunocompetent cells stimulated with different chemicals, we stimulated human monocyte-derived dendritic cells (MoDC), human epidermal keratinocytes (NHEK), and human T cells with 5 different chemicals that affect our immune system, 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB), NiCl2, formalin, diesel exhaust particles (DEP), HgCl2, and analyzed their effects on mRNA expression by these cells using DNA microarray. To exclude the secondary response induced by a danger signal, ATP, we chose the genes which were either up-regulated or down-regulated by each chemical treatment but were not significantly affected by ATP treatment as the chemical-modified genes. We further selected immune-related genes among these genes based on GO term. The following genes were commonly augmented by at least 3 of 5 different chemicals, i.e., IL-1α, IL-1β, IL-8, PBEF1, CSF1 and IRF-1 in MoDC, AKR1C4, GSH1, HMOX1, hsp70, and HBEGF in NHEK, and HMOX1, GADD45A, GILZ, IFN-γ, IL-4, and IL-10 in T cells. Real-time PCR analyses confirmed them. (2) Construction of reporter plasmids. The luciferase reporter assay system was constructed using three different luciferase vectors, pSLG-test/Hygr, pSLO-test/Neor, and pSLR-test/Purr. We used the following promoters: IL-1β, IL-2, IL-4, IL-8, IFN-γ, HMOX1, and G3PDH promoters. (3) Establishment of reporter cell lines We transfected these plasmids into HaCaT keratinocyte cell line, HaCaT, U937 or THP-1 monocyte cell line, and Jurkat T cell line. After selection by antibiotics and cloning by limiting dilutions, we established 20 cell lines and focused on the following 6 cell lines. (4) Development of the screening assay system to detect immunotoxicants Using IL-8 reporter cell, we developed a novel in vitro sensitization test. After evaluating more than 30 chemicals including haptens as well as irritants, the accuracy of IL-8 Luc assay is more than 80% and almost comparable to those of h-CLAT and MUSST.  Using IL-2/IFN-γ reporter cell and IL-1β/IL-8 reporter cell, we developed a novel immunotoxicity screening assay. Based on this assay, we could classify various immunosuppressive drugs into several categories based on their effects on innate and acquired immunities.
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