成果報告書詳細
管理番号20110000001357
タイトル平成20年度~平成22年度成果報告書 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術研究開発) 酵素糖化・効率的発酵に資する基盤研究 ~エクスパンシン様タンパク質を活用した糖化促進法の確立~
公開日2011/9/9
報告書年度2008 - 2010
委託先名財団法人岩手生物工学研究センター
プロジェクト番号P07015
部署名新エネルギー部
和文要約要 約
 セルロース系バイオマスの酵素糖化法の開発に関する基盤研究として「新エネルギー技術研究開発/バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導研究開発)/酵素糖化・効率的発酵に資する基盤研究」が独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構の委託事業として平成20~24年度にかけて行われている。本委託事業は5つの開発項目・分科会(1.原料構造分科会、2.微生物・遺伝子探索分科会、3.酵素糖化分科会、4.発酵分科会、5.総合調整と調査研究)からなり、財団法人岩手生物工学研究センターは、3の酵素糖化分科会に参加した。財団法人岩手生物工学研究センター以外に、財団法人バイオインダストリー協会、長岡技術科学大学、大阪府立大学、三重大学、農業生物資源研究所、食品総合研究所、明治製菓、花王、日揮、旭硝子、長瀬産業、天野エンザイムの各グループが参加した。財団法人岩手生物工学研究センターでは、植物細胞壁にゆるみを与えるエクスパンシン様タンパクおよびいもち病菌に由来する加水分解酵素について研究を行ってきたことから、「エクスパンシン様タンパク質を活用した糖化促進法の確立」の課題で研究を行った。
 財団法人岩手生物工学研究センターのグループは当初の目標を達成したため、平成22年度をもって研究を終了した。本報告書は、平成20~22年度に行った研究成果をまとめたものであり、他の酵素糖化分科会のグループに先んじて報告するものである。
 いもち病菌はイネに感染し、イネの収穫に甚大な被害をもたらす子のう菌である。いもち病菌はイネへの感染および菌糸の伸展を効率的に行うため、イネの細胞壁を効率的に分解していることが推察されている。そこで、いもち病菌がイネの細胞壁分解に利用している細胞壁分解に関与しているタンパク質を植物バイオマスの糖化へ利用するため、これらのタンパク質を同定および酵素科学的に解析を行った。
 いもち病菌が生産している細胞壁分解に関与しているタンパク質を同定するため、いもち病菌のイネへの感染時における遺伝子発現解析を行った。その結果、いもち病菌およびイネの細胞壁の分解に関与しているキチナーゼやセロビオヒドロラーゼ、 β-グルコシダーゼおよびエクスパンシンと相同性を有するタンパク質などを同定することに成功した。イネへの感染時に遺伝子発現が認められるいもち病菌由来のタンパク質の機能を解明するため、リコンビナントプロテインを作製した。リコンビナントプロテインを作製する宿主としては、枯草菌や麹菌、いもち病菌を用いた。本研究では、エクスパンシン様タンパク質、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、1,3-1,4-β-グルカナーゼのタンパク質発現に成功するとともにこれらの酵素科学的な解析を行った。
 いもち病菌由来のエクスパンシン様タンパク質は枯草菌を用いて調製することに成功した。エクスパンシン様タンパク質は加水分解活性を示さないが、セルラーゼ存在下において、セルラーゼによる加水分解作用を促進させることが明らかとなった。
 さらに細胞壁の分解酵素として、いもち病菌由来のセロビオヒドロラーゼやβ-グルコシダーゼ、はいもち病菌や麹菌により生産する方法を確立した。セロビオヒドロラーゼ、1,3-1,4-β-グルカナーゼの酵素生産に成功した。これらの酵素はヒスチジンタグを付与しており、ヒスチジン結合樹脂で精製を行い、酵素化学的な性質を明らかにした。それぞれの酵素の特性を知り、バイオマスである植物の細胞壁糖鎖の分解に適した酵素を利用することが糖化の最適化につながると考えられる。
英文要約 Our study demonstrates identification of DNA, recombinant protein preparation and biochemical characterization of cell wall-related proteins in Magnaporthe oryzae. M. oryzae is the pathogen that causes rice blast, the most devastating fungal disease of rice. During infection into rice M. oryzae secretes a variety of cell wall-dagrading enzymes. Identification of the proteins involved in cell wall degradation leads us to improve the way of efficient saccharification of plant biomass. In the present study, we focused on analyzing the properties and synergistic effects of an expansisn-like protein, cellobiohydrolase and β-glucosidase and endoglucanase from M. oryzae in order to enhance plant cell wall digestion.
Expansins are proteins that induce plant cell wall loosening without any hydrolytic activity, subsequently causing cell enlargement. It is suggested that expansins cleave hydrogen bonds formed between cellulose microfibrils and hemicelluloses such as xyloglucan in dicot and β-1,3-1,4-glucan and xylan in monocot plants. To mine an expansin-like protein that enhances cellulose digestion catalyzed by cellulases, BLASTP search on M. oryzae genome database was carried out using amino acid sequences of plant expansins. As an expansin-like protein from M. oryzae, MoCBP1 was prepared by heterologous overexpression in Brevibacillus choshinensis and the properties in cellulose hydrolysis were analyzed. MoCBP1 showed increased level of cellulose hydrolysis that was catalyzed by cellulase. In addition, MoCBP1 enhanced hydrolysis of the complexes of xyloglucan-cellulose and β-1,3-1,4-glucan-cellulose.
Cellobiohydrolases are key enzymes that efficiently hydrolyze crystalline and non-crystalline cellulose. In genome sequence of M. oryzae, three and four putative cellobiohydrolases in GH 6 and 7, respectively, were encoded. MoCel6A (M. oryzae cellobiohydrolase in GH family 6) was homologously expressed, purified and characterized. MoCel6A revealed hydrolytic activity toward 1,3-1,4- β-glucan, cellulose and phosphoric acid-swollen cellulose. Such property is advantageous to degrade the cell wall of monocotyledonous plants because 1,3-1,4-β-glucan is one of major hemicellulosic polysaccharides. Furthermore, Hydrolysis by MoCel6A was enhanced in the presence of high concentration of cellobiose.
β-Glucosidases are enzymes that produce glucose from β-glucosides. As a result of BLASTP search, 8 putative secretory β-glucosidase genes were extracted from M. oryzae genomic DNA. Two β-glucosidases (MoCel3A, MoCel3B) were overexpressed in Aspergillus oryzae and the properties were investigated. MoCel3A preferentially catalyzes hydrolysis of cellotetra-, cellopenta-, cellohexa-, laminaritetra-, laminaripenta-, laminarihexa- and laminarihepta-saccharides. In addition, MoCel3A liberates glucose from laminarin, β-1,3 polymer. On the other hand, MoCel3B preferentially hydrolyzes cellobiose and laminaribiose. From these results, it is suggested that use of these β-glucosidases with diverse substrate specificities enhances the production of glucose from cellooligosaccharides and laminarioligosaccharides.
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