成果報告書詳細
管理番号20110000000166
タイトル平成21年度成果報告書 研究用モデル細胞の創性技術開発/分子構成を最適化した人工基底膜によるES細胞の分化誘導制御技術の開発(国立大学法人大阪大学担当分)
公開日2011/11/10
報告書年度2009 - 2009
委託先名国立大学法人大阪大学
プロジェクト番号P05010
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約ES細胞の選択的分化誘導に有用な完全合成型人工基底膜を構築するため、(1)細胞毎に最適化された基底膜分子構成の解明、(2)基底膜蛋白質の高発現系・安定供給系の構築、(3)人工基底膜によるES細胞の選択的分化誘導制御技術の開発を柱として研究開発を行い、以下の成果を得た。(1)主要基底膜蛋白質20種に加え、15種の基底膜蛋白質および基底膜関連蛋白質6種の胎生12.5日および14.5日マウス胚における発現部位を免疫組織化学的に解析した。得られた染色結果は、高解像度デジタル画像に変換後、ウェブ上で閲覧可能な画像データベースに収録し、公開した。また、マウス初期胚(胎生8.5~10.5日)の主要基底膜蛋白質20種の局在解析を完了した。これにより胎生5.5日から16.5日までの発生の各段階を通じた基底膜分子構成の情報基盤が整備された。また、心臓、肝臓に対象を絞り、マウス胚発生の各段階および成体臓器での基底膜分子構成を詳細に解析し、心臓の形成初期ではα4鎖ラミニンを主成分とする基底膜が構築され、発生が進むとα2鎖ラミニンが心筋細胞の基底膜に強く発現すること、肝臓の発生初期ではα1鎖およびα3鎖のラミニンが発現し、その局在パターンが血管内皮細胞のマーカーと類似していることを見いだした。(2)β2型ラミニンアイソフォーム5種を含む7種のラミニンアイソフォームの組換え蛋白質発現系を構築し、精製法を確立した。これにより、人工基底膜の構築に必要な全12種のラミニンアイソフォームの組換え蛋白質の高発現・安定供給系が確立された。また、主要な基底膜蛋白質である2種類のニドゲン(ニドゲン-1、ニドゲン-2)と2種のヘパラン硫酸プロテオグリカン(アグリン、パールカン)の発現系を構築し、精製法を確立した。さらに、IV型コラーゲンの脆弱性を克服したI型/IV型コラーゲン混成ゲルの開発に成功した。このようにして得られたI型/IV型コラーゲン混成ゲルと各種ラミニン、ニドゲンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンを組み合わせ、分子組成をカスタマイズした完全合成型人工基底膜の構築に成功した。(3)ヒトES細胞の未分化性維持培養に適した人工基底膜分子を京都大学と共同で探索し、組換えラミニン-511およびラミニン-332がヒトES細胞のフィーダーフリー培養用基材として有効であることを見いだした。また、ヒトES細胞が発現しているラミニンおよびそのインテグリン受容体のタイプを詳細に解析し、ラミニン-511およびラミニン-332がヒトES細胞のフィーダーフリー培養基材として有用である分子基盤を明らかにした。さらに、熊本大学と共同して、ヒトES細胞から肝細胞への選択的分化誘導に有効な基底膜成分を探索し、有効成分を絞り込むことに成功した。
英文要約The goal of this project is to develop a new technology that enables us to induce differentiation of ES cells toward defined cell lineages through manipulation of the basement membrane-like substrata with customized molecular composition. The major achievements made during the fiscal years 2007-2009 toward this goal are as follows. (1) Delineation of the customized composition of the basement membrane by immunohistochemistry: Molecular composition of the basement membrane of mouse embryos of embryonic days 8.5-10.5 (E8.5-10.5) was analyzed by immunohistochemistry with respect to 20 major basement membrane constituents including all subunits of laminin and collagen IV, nidogen-1 and -2, and perlecan. Together with our previous results on E12.5-16.5 mouse embryos, we have now established the immunohistochemical profiles of the basement membrane composition throughout the development of various organs including the heart and the liver. (2) Establishment of high-yield expression systems for recombinant basement membrane proteins: We established recombinant protein expression systems for human laminin isoforms containing b2 chains, i.e., laminin-121, -221, -321, -421, and -521, together with laminin-111, -211, -311, -411, 511, 332, and 213, using human 293F cells that have been adapted to proliferate in suspension culture. We also established expression systems for two nidogens (i.e., nidogen-1, nidogen-2) and two heparan sulfate proteoglycans (i.e., perlecan and agrin). To overcome the fragility of type IV collagen gels that hamper the reconstitution of customized basement membrane-like gels, we developed novel two-composite collagen gels comprising type I and type IV collagens. The resulting composite collagen I/IV gels possess not only the physical stability of the collagen I gel but also the biological activities of collgen IV, thus serving as a superb scaffold for reconstitution of three-dimensional basement membrane-like gels. We have now established a protocol for casting reconstituted basement membranes with defined molecular composition, which will prove to be useful for selective differentiation of ES cells into defined cell lineages. (3) Development of new technology for maintenance and selective differentiation of human ES cells using reconstituted basement membranes: We demonstrated that laminin-511 and -332 support the growth of human ES cells with retention of their pluripotency (collaboration with Kyoto University). We performed a comprehensive survey of the expression profiles of integrins and laminins expressed by human ES cells and provided the molecular basis of the potency of laminin-511 and -332 in supporting the undifferentiated growth of human ES cells under feeder-free conditions. We also screened the basement membrane components that promote the hepatic differentiation of human ES cells.
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