成果報告書詳細
管理番号20110000001426
タイトル*平成22年度中間年報 基礎研究から臨床研究への橋渡し促進技術開発/橋渡し促進技術開発/腸管下痢症経口ワクチンの研究開発
公開日2011/11/23
報告書年度2010 - 2010
委託先名国立大学法人東京大学医科学研究所 一般財団法人阪大微生物研究会 エムジーファーマ株式会社
プロジェクト番号P07022
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約和文要約等以下本編抜粋:1. 研究開発の内容及び成果等 研究開発項目1~(1) : MucoRice-CTBの種子バンク構築 (担当:東大医科研)
設計通りシグナルが切れることが知られている13Kプロラミンプロモータと10Kプロラミンシグナルを用いるワクチンカセットをワクチン米のT-DNAベクターのCTBワクチンカセットとして組み込み、さらに、米の蛋白であるプロラミン及びグルテリンをノックダウンさせるRNAiカセットを同時に組み込み、米の胚乳蛋白質を抑制発現させ、その発現エネルギーと余地を導入ワクチンの発現、蓄積に用いる戦略を用い、加えてCTB分子中4番目アミノ酸アスパラギン(N)をグルタミン(Q)に変換する方法で植物糖鎖付加をなくしたCTBQ1米を作出することで、均一且つ高発現されCTBワクチン米が作出できることは東大医科研で確立しているので、この技術を用いて、ワクチンとRNAiカセットを含むT-DNAベクターとmHPT遺伝子のみを含むベクターをそれぞれアグロベクターに導入したアグロバテリアを、それらを混ぜてコメから誘導したカルスに感染し、ハイグロマイシン選択培地とCTB遺伝子のゲノムPCRにて、候補を選択し、相同組換えにより、mHPTを取り除く方法を用いて、ハイグロマイシン耐性遺伝子マーカーフリー均一CTB発現米の作出を実施しており、現在までに6回のアグロバテリアの感染カルス337株から、95株のCTB/mHPT導入カルスを選択して、第2世代(P2)交配を行い、現在2株のマーカーフリー候補を選択した。来年度には最終マーカーフリー候補を選択し、P3種子を種子バンクとして登録し、サザンDNA解析で遺伝子分析を実施予定である。
英文要約Title:Fundamental Translational Research for the Development of MucoRice-CTB as New Oral Vaccine for the Control of Bacterial Diarrhea.
(FY2010-FY2011)FY2010Annual Report
Establishment of MF-MucoRice seed banking
To prepare Marker free (MF)-MucoRice-CTB suitable for human vaccination traial, the selectable marker gene that confers resistance to antibiotics must be removed from the transgenic rice. With this aim, we very recently established a technical protocol for a selectable-marker-free MucoRice-CTB or MF-MucoRice-CTB by co-transformation of two kinds of Agrobacterium, one carrying a selection marker (HPT gene) cassette alone and the other carrying both vaccine and RNAi cassettes; this was followed by PCR selection for the CTB gene and self-pollination for the next generation. In the progress made in our efforts for the quality improvement of MucoRice-CTB, MucoRice-CTBQ1, with a modification at a glycosylation-sequence site (N6Q), is being used to prepare the final product of MF-MucoRice-CTBQ1.
Development of a stable production system for MF-MucoRice-CTBQ1
To produce MF-MucoRice-CTBQ1 in a fully enclosed molecular rice farming system, we recently established a prototype of closed MucoRice hydroponic GMP factory at the Institute of Medical Science, the University of Tokyo. Using the factory, we are investigating the basic and optimum conditions for year-round MucoRice hydroponics and will produce at least three bulk lots of MF-MucoRice-CTBQ1 for stability and safety testing, as well as for a clinical study in order to obtain “Proof of Concept” for the unsefulness of the MucoRice system as new generation of oral vaccine.
Quality characterization of MucoRice-CTB
Before the establishment of human applicable MF-MucoRcie-CTB, we investigated the location of CTB expression and accumulation in MucoRice-CTBQ1 seeds by immunostaining and by immunoelectron-microscopic analyses performed routinely in our laboratory. We also determined the amino-acid sequence of CTB expressed in the newly prepared improved version of MucoRice by MS-MS analysis.
Specifications of MF-MucoRice-CTBQ1 bulk substance
To determine the stability and safety of human-grade MF-MucoRice-CTBQ1, we need to establish specifications and test methods for the bulk substance. We concentrate on testing for identity (using SDS-PAGE) and quantity (using size-exclusion HPLC) with collararation of National Institue of Heath Sciences.
Although we only have three months in the first year period of the contarct, our project has proceeded smoothly as planned this year.
Due to a big earthquick in Japan, we postponed a kick-off meeting for the NEDO MucoRice Project with the Research Committee and Advisory Members.
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