成果報告書詳細
管理番号20110000001438
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 個別化医療の実現のための技術融合バイオ診断技術開発/染色体解析技術開発/日本人BACを用いた革新的染色体異常解析基盤技術の開発
公開日2011/11/23
報告書年度2006 - 2010
委託先名独立行政法人産業技術総合研究所 トーヨーエイテック株式会社 和光純薬工業株式会社 横河電機株式会社
プロジェクト番号P06012
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約「BACを用いた高精度全ゲノムアレイの開発」では、遺伝学的に日本人と確定されたゲノムを断片化し、大腸菌に挿入しクローン化することにより33万クローンの独自日本人ゲノムライブラリーを作成した。このライブラリーの約2/3のクローンの両末端の塩基配列を解析し、全ヒトゲノムの96%をカバーする日本人ゲノム物理地図を確定した。このライブラリーから人種的特徴を保存するHLA領域のクローンの全塩基配列を決定し、同じ領域の欧米系ヒトゲノム配列と比較し、構造上及び一塩基多型の両者で大きく異なる事を明らかにした。物理的地図から全ゲノム領域をカバーする高精度アレイを設計し、市販4Kアレイと同等の精度の17K アレイを試作した。この高精度全ゲノムアレイにより胃癌培養細胞及び臨床患者由来のDNAを解析し、有用性を確認した。「染色体異常を解析する革新的要素技術の開発」では、(1)SAM (Self assembled Monolayer)や高精度アレイによるDNAアレイチップの開発を行った。熱転写によるアレイ成型基板は高いピッチ精度を示した。独自のスパッタによる金の成膜では、(111)面に優先配向した表面構造が示された。金膜とSAMの至適化によりアレイ上のDNAの特異的結合が示された。さらに試作アレイチップは胃がんDNAサンプルを用いて解析が可能である事が示された。(2)本プロジェクトにおいて、蛍光物質WY547およびWY647を使った新しい蛍光標識試薬を発売した。次に、新規な構造の蛍光物質WY535の誘導体とWY635の誘導体を合成した。これらの蛍光標識ヌクレオチドを本プロジェクトで作製したミニアレイを用いて評価し、十分な輝度が得られることを確認した。(3)物理ハイブリの有効性を確認し、ミニアレイを組み込み開発したハイブリユニットと処理装置のシステムによりハイブリを確認した。読取装置開発では、新マルチビーム・ディスク方式により、深い焦点深度、高感度、高S/N、を確認し2色で液中計測が可能な読取装置を実現した。さらに各成果である日本人BAC、がんのコンテンツ、基板、蛍光標識と同時に連携させ一連の処理をシステムとして動作させ有用性を確認した。(4)大腸癌原発巣から癌細胞のみをLMDで採取し、total RNAおよびgenomic DNAを採取し、1) 発現アレイ、CGHアレイ解析を行った。また、2)遺伝子多型8q24 genotypeとMYC遺伝子発現、allelic imbalance、予後との関係 3)iPS遺伝子群発現の意義、4)上皮間葉移行を制御する遺伝子pathwayの解明を行った。(5)北海道大第一外科では、手術検体を種々の解析をおこなう目的で組織バンクを設立している。これまでに約3600余りの患者検体(血液、組織)を収集し、管理・保存している。患者の個人情報は連結可能匿名化をおこない、各検体には、患者背景、臨床情報がリンクされている。これらの検体を用いてCGHアレイ解析や糖鎖解析などを行っている。(6)胃癌のリンパ節転移、肝転移等の生物学的特性を評価するBACミニアレイを開発した。決定木と他の統計学的手法を用いて50種類のBACクローンを同定して、それらと対照のBACクローンをスポットしたミニアレイを作成した。新規症例を用いた検討では、リンパ節転移、肝転移、腹膜播種、進達度の正診率はそれぞれ66.7%, 86.7%, 86.7%, 96.7%であった。
英文要約Title: (Main theme)Development of a clinical diagnostic technology based on biotechnology merged with another technologies required aiming at personalized medicine.(Theme) Development of a new medical technology to analyze chromosome.

Development of innovative fundamental technologies based on a Japanese BAC Library to analyze chromosomal aberrations:A 33K Japanese genome library was constructed from a genome, characterized genetically as Japanese. By sequencing the both terminal end of 2/3 of the library, a physical map covering 96% entire human genome was established. A complete base analysis of one genome fragment on HLA region revealed the striking difference both structural and single nucleotide polymorphism from European human genome. A 17K tilling array consisted from Japanese genome was built designed from the physical map, and was subjected to validation for cancer clinical DNA.

Development of innovative elementary technologies to analyze the chromosomal abnormalities:(1)We have developed the DNA array chip with the SAM and high precision arrays. Molded substrate by thermal imprint process was shown high precision arrays. Surface structural of Au coating was shown the crystalline orientation of (111). The DNA immobilized was shown specific by optimizing SAM. The prototype array chip was able to analyze the hybridization with the stomach cancer DNA. (2)Development of a new fluorescence labeling technique for CGH analysis
We have released DNA labeling reagents, WY547 and WY647, during this project. We further synthesized newly designed dyes, WY535 and WY635 derivatives. We evaluated the dyes by CGH analysis using a mini array produced in this project and confirmed the fluorescent intensities were sufficient for the analysis.(3)We have validated the correctness and the effectiveness of disease-specific micro array hybridization systems.
Physical Hybridization Systems: We validated the effectiveness of physical hybridization method and confirmed systems’ correct operation.
Deep-focus Scanner: We confirmed its basic performance, such as sensitivity, deeper focus, and high S/N etc., and developed two-color scanner for sample observation in a liquid.(4)The array comparative genome hybridization (CGH) and oligo-microarray in cancer cells from CRC cases wee done by Laser Microdissection. We reported; 1) The clinical significance of both arrays data, 2) Biological significance of CRC carcinogen associated SNP, Significance of iPS genes, and 4) Clinical significance of EMT related genes by microarray.(5)We collect surgical tissue materials from the patients with cancer. Totally we collected more than 3600 specimens. Each sample has been linked clinical information, including pathological factors. We have already analysed of the primary gastric cancer and HCC specimens,(6)We designed a BAC mini-array allowing estimation of biological characteristics such as node metastasis and liver metastasis. A decision-tree model classifier and the other statistical method identified 50 clones. Overall accuracy was 66.7% for node metastasis, 86.7% for liver metastasis, 86.7% for peritoneal dissemination, and 96.7% for depth of tumor invasion.
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