成果報告書詳細
管理番号20110000001460
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 染色体解析技術開発/癌の染色体構造異常の解析と診断のコンテンツ開発、ならびに、個別化医療の実現のための技術融合バイオ診断技術開発/染色体解析技術開発/臨床診断用全自動染色体異常解析システムの開発
公開日2011/11/23
報告書年度2006 - 2010
委託先名株式会社ビー・エム・エル 国立がん研究センター 日本ガイシ株式会社 富士フイルム株式会社
プロジェクト番号P06012
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約要約(和文)
[記載項目]
1. 研究開発の内容及び成果等
 癌及び遺伝性疾患の個別化医療を実現するために、染色体微細構造異常に焦点をあてそれを解析するための診断用ゲノムアレイの開発と診断用全自動染色体異常解析システムの開発を目的とする。全ての開発研究は東京医科歯科大学難治疾患研究所(稲澤研究室)と共同で推進した。
1)診断用ゲノムアレイの開発
先天性疾患を診断するためのGDアレイの開発
 新規開発のDualハイブリ法を用いたGDアレイ(GD7-00)による先天異常症ゲノムコピー数異常診断システムを確立し、GD-700の製造(富士フイルム株式会社)及び臨床検査受託(株式会社ビー・エム・エル)を開始した。また、GD-700の検査用途を不育症分野にも広げた。
WG15000アレイの作製とCNVデータベースの構築
 ヒト全染色体を網羅する15,000種類のBACプローブを搭載した高精度ゲノムアレイWG15000解析システムを開発した。貼付するBACクローンの約10%(1500クローン)はFISH法で染色体マッピングした。
癌の染色体異常の解析と個別化医療での診断コンテンツの開発
 癌の個性診断用にミニアレイ(MCG Cancer Array-Mini)を開発した。本プロジェクトで開発する集中型および分散型自動解析装置に対応するものである。
 癌個性診断用MCG Cancer Array-Mini(33クローンセットおよび108クローンセット)を用いて各種癌でパフォーマンスを検証し、高精度検出能の確認および実用化の可能性を示した。
 通常型腎細胞癌のゲノムコピー数異常解析から予後と相関するゲノム異常を抽出した。大腸癌のゲノムコピー数異常解析から増幅遺伝子候補とホモ欠失遺伝子候補を抽出した。腎癌低分化型胃癌に特徴的な13q22ゲノム増幅と胃癌のびまん性増殖に関連するKLF12遺伝子を同定した。低分化型胃癌におけるチロシンキナーゼ遺伝子のコピー数異常解析とキナーゼドメインの網羅的シークエンス解析を実施し、胃癌に関与するチロシンキナーゼ遺伝子を同定した。高分化型胃癌のホモ欠失4q13および5q21より2つの癌抑制遺伝子を同定した。肺神経内分泌腫瘍の染色体6p22.3増幅と予後不良に相関する標的遺伝子DEK癌遺伝子を同定した。
 2) 診断用全自動染色体異常解析システムの開発
アレイCGH分散型全自動染色体解析装置の開発
 ファイバー取り回しの改良による導光ロスの低減、測定励起波長の変更によるLED励起光量アップ、測定条件の最適化による光学系ロスの低減対策により、低シグナルスポット(濃度10nMまで)の検出に成功し、市販検出器より低コストでほぼ同等な検出感度を得ることができた。CNV既知の癌細胞株DNAを用いてアレイCGH検査の全自動化を評価した。その結果、“高度な増幅”、“増加”、“減少”などのCNVが検出され、正解率77%を得た。定量的解析精度、再現性等の課題はまだ残るもののアレイCGH検査の全自動化に目処を立てることができた。
集中型全自動染色体異常解析装置の開発
 標識・抽出・解析の三工程を並行して開発し、標識工程と抽出工程については平成21年度までに完成した。平成22年度は解析工程のスキャナーを改良した。全自動化システムを、既知染色体異常細胞のゲノムDNAを試料に評価を行いCNV検出が可能であることを確認した。今回開発の集中型全自動機がアレイCGHを評価できるレベルにあることを確認し、開発を完了した。
英文要約要約(英文)
We established the diagnostic system to detect pathogenic copy number variations (CNVs) responsible for known multiple congenital abnormalities with mental retardation (MCA/MR) by modified array-comparative genomic hybridization (aCGH) using genomic disorder array (GD-700) in the clinical setting. In our system, the newly developed “Dual hybridization” was employed to detect copy number difference between normal diploid and test DNAs. Fujifilm Co., Ltd. and BML initiated the commercial production of GD-700 and the clinical testing for patients with MCA/MR in October 2009, respectively. A high-density array containing 15,000 BACs (WGA15000) was constructed, and “MCG Cancer Array (CA)-Mini” harboring 108 BACs was constructed as the diagnostic tool for personalized cancer medicine. Multiple genomic loci with copy number alterations associated with poor prognosis and/or recurrence of the respective cancers have been identified in clear cell renal cell carcinoma, gastric adenocarcinoma, pancreatic adenocarcinoma, hepatocellular carcinoma and lung cancer. Cancer-related genes have been identified from those genomic regions with CNVs: KLF12 as the target gene of 13q22 amplification in poorly differentiated gastric cancer; two novel genes as tumor suppressors of 4q13 and 5q21 homozygous deletions, respectively, in well differentiated gastric cancer; DEK oncogene as the target of 6q22.3 amplification in lung cancer. Resequencing of the tyrosine kinase gene family in poorly differentiated gastric cancer has identified non-synonymous mutations accompanied by copy number alterations in several tyrosine kinases (TIE1, TEK, ERBB2, HCK and BTK). For the development of “point of care” analyzer to be used mainly in a hospital laboratory, we have established the fully-equipped automated analyzer consisting of the genomic hybridization module, the pretreatment module and the detector by the improvement for a recovery of DNA, and a noise in background signal as well as Coefficient of Variation (CV) in BACs loaded on a mini-array. We evaluated the detection-power for CNVs for clinical specimens in FY2010. For the development of high-throughput analyzer to be used in centralized clinical reference laboratories, we have improved the uniformity in a hybridization process, the signal-noise ratio and accuracy during scanning process, the User-Interface Software aiming at a superior handling performance in operations for the analyzer, and the process to prepare a control DNA suitable for “Dual hybridization” protocol in addition to the development of a new software. The resultant prototype (ver.3) of the fully-automated analyzer evaluated and confirmed to detect CNVs precisely with genomic DNAs prepared from clinical samples in FY2010. All subjects were performed in collaboration with Dr. Johji Inazawa’s lab in Tokyo Medical and Dental University.
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