成果報告書詳細
管理番号20110000001489
タイトル平成18年度~平成22年度成果報告書 新機能抗体創製技術開発
公開日2011/11/23
報告書年度2006 - 2010
委託先名一般財団法人バイオインダストリー協会  独立行政法人産業技術総合研究所
プロジェクト番号P06009
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約A)系統的な高特異性抗体創製技術の開発
 GPCRを含む癌表面マーカータンパク質およびその関連タンパク質に対する抗体作製のため,抗原発現バキュロウイルス、定常発現細胞等を作製した。疾病のマーカー候補として癌,心血管疾患,精神神経疾患,骨運動器疾患,糖尿病等,計165種類244抗原を作製した。うち取得抗体数は130項目558クローンである。うち治療用抗体候補6種類、診断用抗体候補6種類を取得した。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)に対するモノクローナル抗体 (mAb) を効率的に作製するための大腸菌由来Gro-ELを分子アジュバントとした改良DNA免疫法を確立し、機能性抗体を含む10種類の抗GPCR mAbを作製した。末梢性免疫寛容の打破を目的として制御性T細胞(Treg)を除去した細胞を移入したマウスを免疫動物として、2種類の自己抗原に対する抗体作製に成功した。TNFRIIFc-Fcは、TNFRII-Fcに比べて、Fc受容体に対して強い親和性を示し、細胞膜上にTNFαを発現した細胞に強いADCC活性を発揮した。再構築型無細胞蛋白質合成系PURE systemによる高効率リボソームディスプレイ(PURE RD)を確立した。このシステムにより、scFv、Fab,スキャフォールドの選抜系を開発した。変異機能のON/OFF制御可能なニワトリB細胞株DT40-SWを用いて、効率的な抗体作製システムを開発することに成功した。ニワトリモノクローナル抗体作製技術の高度化と複数の有用抗原に対する抗体作製、ニワトリ抗体のキメラ抗体化、ヒト抗体化などの実験を行い、優れた抗体の作製・改変に成功した。乳がんと膵がんにおいて9個のエクソンスキップと6個のがん特異的融合遺伝子を同定した。抗体作製用のマウスは6種を作製した。
B)高効率な抗体分離精製技術の開発
 抗体結合性を有する新規タンパク質の設計・創製技術の開発、多品種の抗体分子に対応可能で、結合・解離特性の優れたタンパク質分子リガンドを迅速・安価に提供するための設計技術、合成技術、評価技術の観点から行い、低コストで且つ効率の良い配向制御固定化を可能にするアフィニティリガンドの基本配列様式を開発し、これをプラットフォームとし、各種抗体に対応できる骨格配列を収集することにより、一次ライブラリーを作製した。一次ライブラリーの中から高親和性を示した3種類の骨格配列について、網羅的一アミノ酸置換を行い、二次ライブラリーを作製した。多数のリガンドIgG結合特性を同時に評価できる固定化リガンドのハイスループット分析装置と、多数の溶媒に対する特定のリガンドからのIgG溶出パターンを順次測定できる装置を開発した。商業スケールでモノクローナル抗体を高効率に精製するため、化学的安定性を有するシリカ担体を開発し、cGMP準拠の製法を確立した。リガンド評価装置用として、ガラス板上薄層モノリスシリカゲル、およびミクロサイズモノリスカラムを開発し、品質の安定した製造技術を確立した。IgG様抗体を生産する3種類のCHO細胞ラインを構築し、無血清培地で順養した。また、動力学的パラメータと抗体多様性を、構築したレクチン結合アッセイを使用して小規模フェドバッチ培養で評価した。24種類のヒトもしくはヒト型化モノクローナル抗体を精製技術検証用パイプラインとして用いそれを発現するCHO細胞培養液から精製を行い、精製抗体の品質と機能を評価することで開発した精製技術の検証を行い、技術の有用性を確認した。
英文要約Title:Development of New Functional Antibody Technologies(FY2006-FY2010)Final Report
A)Development of integrated technology to generate antibodies of high specificity
 To generate high affinity monoclonal antibodies, we established recombinant baculoviruses displaying G-protein coupled receptor on the viral particle. We have prepared 244 recombinant viruses which display marker candidate proteins for various cancers, diabetes, neuropsychiatric disorder, or cardiovascular diseases, and established 558 monoclonal antibody clones including 6 candidates for therapeutic antibodies.To break the peripheral tolerance, we developed a method to immunize mice depleted of regulatory T cells (Treg).The fusion protein (TNFRII-Fc-Fc) showed higher avidities for Fc~ receptors, resulting in enhanced ADCC activities to TNFα-bearing cells. Furthermore, TNFRII-Fc-Fc was more effective than TNFRII-Fc in therapy of mice suffering from DSS-induced colitis. Using reconstituted cell-free translation system, PURE system, highly efficient ribosome display method (PURE RD) was established. By this system, scFv, Fab and scaffold were selected. We established an efficient antibody generating system using chicken B cell line, DT40-SW, in which mutation machinery can be reversibly switched. We promoted successfully the advancement of chicken monoclonal antibody technology. Furthermore, establishments of useful chicken monoclonal antibodies and their reconstructions to chimeric and humanized antibodies were also successful. We identified 9 genes with cancer specific skipped exon and 6 novel cancer specific fusion genes in breast or pancreatic cancer. We established 6 knock-out mice for efficient generation of antibodies.
B) Development of High Performance Separation Technologies for Antibodies
Versatile IgG binding proteins with strong-affinity at binding conditions and effective dissociation profile at mild elution conditions, applicable as an affinity ligand wide range of molecular species of monoclonal antibodies was developed from the points of protein design technologies, protein libraries, low cost productions, and evaluation technologies. We also developed a novel platform for affinity ligand with enabling orient-controlled immobilization with high efficiency and low costs.For the effective industrial-scale purification of monoclonal antibodies, silica-based media with high chemical stability was developed and manufactured according to cGMP standard. Thin layer monolith silica gel on the glass plate and micro size monolith column were developed and established the manufacturing procedure for ligand evaluation instrument. Serum-free adapted 3 Chinese hamster ovary (CHO) cell lines producing IgG-like model antibodies and standardized preparation protocol using these cell lines were established. The antibody varieties were evaluated in small-scale cell culture using constructed high-sensitive assay. To evaluate the developed purification technology, 24 monoclonal antibodies were chosen as production pipelines and 19 antibodies of them were highly purified with good quality and efficiency. Thus, the availability of the technologies developed in this project was evaluated.
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