成果報告書詳細
管理番号20110000001492
タイトル平成20年度~平成22年度成果報告書 基礎研究から臨床研究への橋渡し促進技術開発/橋渡し促進技術開発/臓器線維症に対するVA~ポリマー~siRNAを用いた新規治療法の開発
公開日2011/11/23
報告書年度2008 - 2010
委託先名日東電工株式会社
プロジェクト番号P07022
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約肝硬変をはじめとする臓器線維症は、慢性的な感染症や代謝性疾患、臓器の傷害などが原因として発症する。近年、臓器線維化の本質は、臓器において星細胞がコラーゲンを過剰分泌することに起因することがわかってきた。また星細胞はビタミンA(VA)を特異的に取り込むこと、またコラーゲン分子のプロセシングには、分子シャペロンとしてHSP47が必須である事が知られている。そこで我々は、HSP47に対するsiRNAを、VAを付与した合成キャリアーを用いて星細胞に特異的に送達する線維症の治療戦略を考案した。本事業の目的は、この発想に基づいた新規な臓器線維症の治療法の開発を目指し、星細胞に特異的なVAポリマー-siRNAの開発と、siRNAによる肝硬変治療のメカニズム解明、またその再生医療における位置づけを検討項目とした。VA-ポリマー-siRNAについては、試作品を肝硬変を発症した動物に投与したところ、肝硬変が改善する結果を得たことから、これが現実的な方法論であることを実証した。その上でsiRNAデリバリーに必要な機能を最適化するため、ポリマーに組み込む分子の組み合わせを検討した。また肝硬変治療のためのsiRNAを検討したところ、ヒトと齧歯類で共通の配列で肝硬変モデル動物の治療が可能であり、またヒト由来星細胞でもsiRNAのノックダウン効果を確認したことは、ヒトでの治療の実現性を支持するものであった。また肝硬変臓器の特異的なイメージングに成功した。すなわちマウスにVA付与したキャリアーでモデル造影剤(蛍光物)を投与したところ、肝硬変マウスでは正常マウスよりもより強い蛍光シグナルが肝臓部分で観察された。この結果を受けて、臨床応用可能な造影分子にVAを結合させた造影剤を検討している。さらに、肝硬変の治療メカニズムの解明にも取り組んだ。本治療法により線維化組織で沈着したコラーゲン線維が融解することから、その機構を解析したところ、siRNAgp46により活性型星細胞からのコラーゲン分泌が抑制されるのに伴い、肝硬変組織に浸潤している炎症細胞から分泌されるコラゲナーゼ活性が相対的に優位となり、既に組織に決着しているコラーゲン線維を融解することが明らかとなった。さらに活性化星細胞はコラーゲン分泌に伴って細胞の生存シグナルが惹起され、siRNAgp46によるコラーゲン合成阻害によりこのシグナルが抑制されるとともに、最終的にアポトーシスが誘導されることがわかった。また本治療法の安全性を確認する目的で、正常肝星細胞に対するVA-Lip-siRNAgp46の作用を解析した。その結果、活性化星細胞はコラーゲン分泌に伴って細胞の生存シグナルが惹起され、siRNAgp46によるコラーゲン合成阻害によりこのシグナルが抑制されるとともに、最終的にアポトーシスが誘導されることがわかった。これに対し、正常星細胞はsiRNAgp46に対し非感受性であった。また正常ラットにVA-Lip-siRNAgp46を繰り返し投与しても動物に異常は認められなかった。これらのことは本治療法の安全性を裏付けるものであった。さらにDMN肝硬変ラットをVA-lipsiRNAgp46で治療するとほぼ正常の組織構築が回復されることから、この肝再生の現象のメカニズムの機構を検討したところ、肝幹細胞は、肝実質細胞、胆管細胞、血管内皮へと分化することなどから、本治療法が単に肝硬変の線維組織を消失させるのみならず、肝再生を惹引する治療法でもあることが証明された。
英文要約Title: Development of therapeutic modality for fibrosis by the use of VA-polymer-siRNA. (FY2008-FY2010) Final Report
Fibrosis is triggered by multiple factors for example chronic infectious diseases, metabolic diseases and tissue damage. Recently, it was revealed that the major cause of fibrosis is over production of collagen by stellate cells. Also, it is known that stellate cells accumulate vitamin A (VA), and that in these cells, heat shock protein 47 (HSP47) is playing a role of molecular chaperone for collagen. The principal investigator of this project proposed a system that delivers siRNA targeting HSP47 gene by the use of synthetic carrier coupled with VA. The objective of this project was to develop a novel therapy for fibrosis based on this concept, and to develop siRNA polymer delivery carrier to stellate cells. We successfully conducted a proof-of-concept study that polymer compound that possesses VA (VA-polymer) can be utilized as an siRNA delivery platform for liver cirrhosis therapy. Then, functional molecules to improve siRNA delivery efficiency of polymer were investigated and designed. Also, siRNA for the treatment which has homology to human and rodent was designed. The efficacy of the siRNA was confirmed by the therapeutic efficacy in fibrosis model animal and successful knocking down of HSP47 in human stellate cells, thus these results supported the potency as a therapy for human. Moreover, the same stellate cell targeting principle was applied to imaging of liver cirrhosis. Fluorescently labeled VA-carrier was administrated to liver cirrhosis model mice, then the animals were observed by non-invasive imaging system. The distribution of fluorescence was mainly observed only in cirrhotic liver by the use of VA-carrier, thus it was confirmed that VA-carrier is highly potent as a delivery platform for non-invasive diagnosis of fibrosis. Therefore, VA is also potent for imaging fibrosis combining with actual imaging agent for clinical use. On the other hand, the mechanism of the treatment, especially the functions of VA-polymer-siRNAgp46 in hepatic stellate cells were unclear. We disclosed that siRNAgp46 clearly suppressed collagen deposition and also induced apoptosis of activated hepatic stellate cells. However quiescent hepatic stellate cell was not sensitive to siRNAgp46-induced apoptosis. Moreover, after series of siRNA injection to normal rats, no significant change in blood biochemistry, histology, distribution of quiescent hepatic stellate cells, cytokine induction, and abnormal immunoglobulin elevation were observed. Those results strongly support the safety of this therapy. Furthermore, we reported that this therapy is not just resolve fibrosis but also leads regeneration of liver tissue after treatment. As liver stem cells were differentiated into hepatocytes, cholangiocytes during treatment of cirrhosis with siRNAgp46, we concluded that this therapy not only resolves collagen deposition but also induces liver regeneration.
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