成果報告書詳細
管理番号20110000001509
タイトル平成22年度成果報告 iPS細胞等幹細胞産業応用促進基盤技術開発 /細胞質交換法を基盤とした新規iPS細胞作成法とその細胞標準化システムの研究開発
公開日2011/11/23
報告書年度2010 - 2010
委託先名国立大学法人東京大学
プロジェクト番号P08030
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約本開発研究では、村田グループが独自に開発してきた「セミインタクト細胞リシール技術」の利点をフルに活用し、万能性誘導に関わる山中の4因子のリコンビナントタンパク質(His~Oct4, GST~SOX2,GS~KlF4,GST~c~Myc)導入よるインテグレーションの無いゲノムを持ったiPS細胞の作成を目指した。最終的に、GFP~Oct4とその上流配列をノッククインした調製したマウスにMEF細胞(MEF~GFP~Oct4)をセミインタクトMEF細胞にし、そこにL5178Y細胞質と山中の4因子タンパク質を導入したリシール細胞から、多数のiPS様コロニーを簡便に得る方法を構築した。光学顕微鏡による経時観察の結果、リシール後10時間経過頃から、GFP~Oct4陽性細胞が観察されはじめ、その後、GFP~Oct4陽性細胞が次々と集合して、リシール後20時間~30時間頃には平均直径~100μmのiPS様コロニーが形成される様子が観察された。そして、リシール後20時間~30時間頃には、Oct4/Nanog/SSEA1などのiPS細胞形成のマーカータンパク質全てに陽性のiPS様コロニー(直径100~200μm)を形成したが、5~7日後からはiPS様コロニー内の細胞増殖は停止し、目的のiPS細胞形成には至らなかった。しかしリシール法は細胞内環境の改変を再現性よく解析できることが分かりiPS細胞樹立の課程の解析に利用可能と考えられた。リシールされたiPS細胞様のコロニーの評価法を確立するため、すでにキメラ形成能の評価されている細胞を材料に、エピゲノムによる細胞評価系の構築を行った。iPS細胞の評価に当たっては、ゲノムワイドDNAメチル化プロフィール解析法であるD~REAM法を用い、分化多能性細胞の標準細胞であるES細胞と体細・組織の比較から、分化多能性を特徴付けるT~DMRを抽出した。その結果分化多能性細胞のDNAメチル化プロフィールは1)分化多能性の樹立と維持に関係するOct4を代表とする転写因子群と、ESで発現する遺伝子からなる標的領域の脱メチル化、2)分化した細胞・組織特異的遺伝子のメチル化とSall4の結合による抑制を特徴とすることが分かった。この情報を基にiPS細胞を評価したところ、iPS細胞は、キメラ形成能の良否に関わらずES細胞で脱メチル化している遺伝子ネットワークはよく脱メチル化されているものの、表現系として検出されない分化細胞、組織特異的遺伝子おいて、親細胞の脱メチル化情報が一部残された不完全な状況にあり、不完全さとキメラ形成能の低さとの関連を認めた。さらにこれらのT~DMRは遺伝子領域のみならず遺伝子間にも存在し、DNAメチル化によって抑制され染色体の安定性に関与するレトロトランスポゾンの分布とDNAメチル化プロフィールにも相関を認め、非遺伝子領域を含めた解析が重要であることが分かった。これらのゲノムの特徴とDNAメチル化プロフィールの関連は、ヒト・マウスES細胞で共通していた。DNAメチル化プロフィールによる評価は、iPS細胞が、表現系として現れない組織特異的遺伝子領域にDNAメチル化異常を持ち、細胞の将来運命、すなわちiPS細胞の分化多能性に対し影響を与えていることを示唆しており、DNAメチル化プロフィール解析は、これまでの表現系を中心とした解析では得ることのできない情報を提供する新しいiPS細胞の評価法として重要であることが分かった。
英文要約Title: Fundamental Technology Development for Promoting the Industrial Application of iPS Cells. Research and development of a novel generation method and a standardization system for iPS cells (FY2009-FY2011) Final Report
To generate the safer puluripotent stem (iPS) cells without using retroviral systems, in this project, we aim to develop a novel method for protein-induced generation of iPS cells from mouse embryonic fibroblasts (MEF) by semi-intact cell resealing techniques. In brief, we prepared MEF-GFP/Oct4 cells from knock-in-mouse that have GFP-Oct4 reporter gene. Then, we introduced the four recombinant reprogramming proteins (His-Oct4, GST-Sox2, GST-Klf4, GST-c-Myc) with the cytosol into semi-intact MEF-GFP/Oct4 cells, followed by resealing the cells. Microscopic analysis revealed that the resealed cells expressed GFP-Oct4 within 10-15 hr after the resealing and within 20-30 hr they expresses typical pluripotency markers, Oct4, Nanog and SSEA1, and formed iPS cell-like colonies with diameter about 100-200~m. However, in at least 5-7 days after resealing, the iPS cell-like colonies appeared to arrest their proliferation. These results indicate that introduction of four reprograming proteins in the resealed cells induced the substantial change in chromosomal epigenetics to the undifferentiated state but was not sufficient to stimulate the proliferation or to regulate the timing of protein’s functions. To analyze the pluripotent cells, we applied D-REAM, a genome-wide DNA methylation profiling method, using embryonic stem (ES) cells as a standard. By comparison of ES cells with somatic tissues, we identified ES T-DMRs, which illustrate a standard DNA methylation profile of pluripotent cells. EShypo T-DMR and EShyper T-DMRs illuminated the transcription network consisting of key transcription factors, as Oct4, and their target gene, and repression of tissue specific genes associated with DNA methylation, respectively. iPS cells exhibited closely similar DNA methylation profile consisting of EShypo T-DMRs, with which associated genes were expressed in ES cells, however, defects in DNA methylation at EShyper T-DMRs associated with genes not expressed in ES cells. Degrees of the defects in EShyper T-DMRs were correlated with less efficiency of those cells in the chimera formation assay. EShypo and EShyper T-DMRs were identified in not only gene regions but also intergenic regions, and exhibited enrichment of SINEs and LINEs, which are dominant retro-transposons in mammalian genomes, around them, respectively. The genomic characteristics associated with ES T-DMRs were common in mouse and human genomes. In conclusion, DNA methylation profile revealed epigenetic defects in mouse iPS cells at genes, which could not be revealed by transcriptome analysis, and suggested that these defects would have impact of their pluripotency. DNA methylation profiling of iPS cells will be useful for evaluation of pluripotency of iPS cells.
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