成果報告書詳細
管理番号20110000001444
タイトル平成21年度~平成22年度成果報告書 グリーン・サステイナブルケミカルプロセス基盤技術開発 化学品原料の転換・多様化を可能とする革新グリーン技術の開発 バイオマスを原料とした有機酸の高効率製造方法開発とその品種展開の研究開発
公開日2011/12/13
報告書年度2009 - 2010
委託先名旭硝子株式会社
プロジェクト番号P09010
部署名電子・材料・ナノテクノロジー部
和文要約第1章 L-乳酸製造プロセスの開発について
 これまでに、S. pombe のL-乳酸生産株を用いたL-乳酸生産試験を行い、小スケール培養装置を使用した生産系の確立を行なっている。
本開発では、さらにパイロットスケール培養装置(90L)を用いたスケールアップを行い、小スケール培養装置を用いて得られた結果の再現性を確認することにした。
流加培養では、培養48時間で、小スケール培養装置で実施した場合と同程度の高濃度菌体が得られ、試験管による乳酸発酵能も確認された。
さらに、分離板型遠心分離装置を用いて分離した菌体を使用し、当パイロットスケール培養装置による発酵試験を行なったところ、小スケール培養装置の場合と同等の乳酸生産量、対糖収率が得られた。
一方、発酵生産物の連続的な分離方法の確立を、中空糸分離膜装置を用いて実施した。そこで、流加培養菌体を膜濃縮後、連続ろ過発酵試験を実施した。連続ろ過発酵開始48時間後に定常化がみられ、それ以降の乳酸生成速度は5.5g/Lhで、対糖収率は70%となり、小スケール培養装置の場合と同等の結果が得られた。
 第2章  D-乳酸生産系の構築と改良について
D-乳酸脱水素酵素(D-LDH)の中から、活性と利用の簡便性を基に、7種の生物由来のD-LDHを選定した。これらの中から6種のD-LDH遺伝子を選び、S. pombeで発現させた。続いて、試験管培養レベルでD-乳酸生産を確認後、D-LDH遺伝子3種への絞り込みを行った。さらに、菌体増殖速度の確認結果によって、1株に絞り込み、小スケール培養装置を使用した流加培養、発酵条件検討を行なった。その結果、D-乳酸の生産速度11g/Lh、対糖収率70%が見込まれることを確認した。
第3章  汎用有機酸製造用酵母の構築について
 S. pombeを使用した3-HP(3-ヒドロキシプロピオン酸)生産株作製の技術開発を行い、グリセロールからの代謝経路経由での3-HP生産を確認した。今後は、さらに関連酵素発現の増強のため、他由来種の酵素遺伝子の導入や異なる代謝経路を利用した新たな3-HP生産系の開発を行なう必要性が示唆された。
英文要約CHAPTER 1.
DEVELOPMENT OF L-LACTIC ACID MANUFACTURING PROCESS
In our previous study, we succeeded in L-lactic acid production at the small fermentation scale of 2~5L using a recombinant S. pombe strain, which was transformed with a heterogeneous L-lactic acid dehydrogenase(L-LDH)gene. In present study, a scale-up productivity analysis was performed using a pilot-scale (90L) fermenter in order to test the reproducibility of our previous data. At first, fed-batch fermentation was performed for the L-lactic acid-producing recombinant S. pombe strain using the 90L-fermenter. After 48 hours of the fermentation, a cell density similar to our previous study was achieved. The obtained cells also gave similar L-lactic acid productivity at test assay. Furthermore, using the same pilot scale (90L) fermenter, L-lactic acid fermentation was performed for the cells harvested from above fed-batch with a disk-type centrifuge. Consequently, the same data for L-lactic acid productivity and yield of glucose was reproduced.
Additionally, a continuous filtration of the fermentation product using a hollow fiber separation system was attempted throughout the fermentation process in order to establish a novel fermentation- filtration coupled production and separation process. In such purpose, continues filtration was performed during the continuous fermentation process. As a result after 48 hours of the fermentation, the fermentation rate was stabilized at the level of 5.5 g/Lh with the 70% yield per glucose. This indicated the same result obtained at the small scale (2-5L).
CHAPTER 2.
CONSTRUCTION AND IMPROVEMENT OF D-LACTIC ACID MANUFACTURING PROCESS
Next to above L-lactic acid production, we also attempted to develop production of D-lactic acid using similar approach. In such purpose, we selected seven types of homologous D-lactic acid dehydrogenase(D-LDH)genes depending on the information about their enzymatic activity and usability after expression. Excepting one of them, others six D-LDH genes were transformed into the S. pombe strain, respectively, in order to construct recombinant strains. Then, three strains were selected after determining the D-lactic acid productivity of each strain at test tube level. Finally, the best strain was selected depending on the cell growth ability. The finally selected strain was cultured with fed-batch fermentation at the small scale (2-5L) in order to analysis its productivity, growth ability and other cultivation conditions. Consequently, 11g/Lh of D-lactic acid producing rate and 70% yield per glucose were indicated.
CHAPTER 3.
CONSTRUCTION OF YEAST SYSTEM PRODUCING UNIVERSAL ORGANIC ACIDS
We also attempted to construct a novel S. pombe strain producing 3-HP (3-hydroxypropionic acid) as an universal organic acid model by metabolic pathway engineering of the S. pombe with gene manipulation techniques. Initially, we succeeded in 3-HP production from glycerol pathway of the resultant recombinant S. pombe strain at test tube level. Further approaches for productivity improvement are now ongoing by engineering other metabolic pathways or increasing expression level of each introduced genes related to the 3-HP production pathway.
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