成果報告書詳細
管理番号20100000001570
タイトル平成21年度成果報告書 モデル細胞を用いた遺伝子機能等解析技術開発/研究用モデル細胞の創製技術開発(国立大学法人京都大学担当分)
公開日2012/12/26
報告書年度2009-2009
委託先名国立大学法人京都大学
プロジェクト番号P05010
部署名バイオテクノロジー・医療技術開発部
和文要約 本研究開発は、均質な遺伝的背景を有し、無限に増殖できるとともに、あらゆる細胞組織に分化できる多能性を有するヒトES細胞(ヒト胚性幹細胞)を対象に、遺伝子の相同組換え、RNA干渉による遺伝子サイレンシング技術等を用いてヒトES細胞を加工し、様々な分化誘導因子を用いて分化誘導を制御する基盤技術を確立するとともに、当該技術を用いて遺伝子機能や細胞内ネットワークの解明、薬剤候補の安全性の向上といった創薬の基盤研究に資する研究用モデル細胞の創製を行うことを目的とし、1)ヒトES細胞の加工技術開発、2)ヒトES細胞の分化誘導制御技術開発、3)研究用モデル細胞の構築技術の開発を実施する。京都大学では1)及び2)を担当した。
1) においては、遺伝子導入と発現制御技術の開発、相同組み替え技術の開発、RNA干渉法による遺伝子発現制御技術の開発を行った。遺伝子導入と発現制御技術の開発ではヒトES細胞における遺伝子導入法の検討からはじめ、Tet-On/Offを用いた遺伝子発現制御技術の開発に成功した。また相同組み替え技術の開発では幹細胞創薬研究所で開発した技術を導入し、それを改良することで、複数のヒトES細胞から遺伝子相同組み替えに成功し、さらにヒトiPS細胞においても達成できた。RNA干渉法についてもマウスES細胞を用いての基盤技術開発に成功し、我々が開発したヒトES細胞での導入遺伝子発現制御技術と組み合わせることで大きな可能性が開けた。
においては、心筋細胞への分化誘導技術開発、肝細胞への分化誘導技術開発、人工基底膜、疑似マトリックスの評価を行った。心筋細胞への分化誘導についてはマウスES細胞において心筋分細胞及び心筋前駆細胞の誘導効率を10-20倍促進する方法を開発した(サイクロスポリンA投与法)。同方法はヒトES細胞やヒトiPS細胞においても有効であることを見出した。また肝細胞への分化誘導に関しても、熊本大学とは異なる支持細胞を用いない方法で、ヒトES細胞から肝細胞への分化誘導法の開発に成功した。また幹細胞創薬研究所と共同開発で、肝成熟を有するマウス胎児肝臓由来のストローマ細胞株を見出した。さらに両者を組み合わせることで、ヒトES細胞から成熟肝細胞への分化誘導に向けて大きな前進をもたらした。人工基底膜、疑似マトリックスの評価においては、ヒトES細胞の未分化維持に効果のあるラミニンの特定に成功した。さらにそのラミニンはヒトiPS細胞においても効果があることを見出した。これらの成果を国際誌での発表あるいは特許申請を行った。
英文要約Annual Report on Progress in the Development of Technologies for Model Cells from Human Embryonic Stem Cells
(A) Progress in Human Embryonic Stem Cell Engineering
Development of efficient gene transfer systems and inducible gene systems for human embryonic stem cells: Progress in human genetic engineering depends on the development of efficient gene transfer systems and inducible gene systems for the creation of model cells from human embryonic stem (ES) cells. We first investigated various transfection reagents and found FuGENE HD (Roche) to be the most effective reagent for the transfection of human ES cells. In addition, we established the Tet-On inducible gene system for human ES cells.
Development of homologous recombination techniques for human embryonic stem cells: We isolated HPRT genes from KhES1 human ES cells and constructed homologous recombination cassettes. We modified the electroporation protocol for human ES cells and thus achieved a homologous recombination frequency of from 2.5-3% at the HPRT locus in two human ES cell lines, as well as in a human iPS (induced pluripotent stem) cell line.
Generation of the gene regulation system using RNA interference in human ES cells: We aimed to generate a gene regulation system using RNA interference (RNAi) in human ES cells, and tried to establish human ES cell lines in which short hair-pin RNA (shRNA) can be induced by the addition of chemical reagents to suppress the corresponding target genes at various differentiation stages. We first succeeded in establishing a tetracycline-inducible shRNA expression system with a cre-loxP system using mouse ES cells. We are currently attempting to apply these systems to human ES cells.
(B) Progress in Inducible Differentiation in Human Embryonic Stem Cells
Novel differentiation system of mouse and human ES cells to cardiomyocytes: We examined various culture conditions to efficiently induce cardiomyocytes and found that an immunosuppressant, namely cyclosporine-A (CSA), induced an increase in the number of cardiomycytes from Flk1-positive mesoderm cells by approximately 10-20 times in comparison to the control. CSA also substantially increased the cardiac progenitor population. Currently, we are examining the cardiogenic effect of CSA on human ES cells.
Development of systems for the induction of differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes: We intended to mature hESCs into functional hepatocytes using a two-step method; first, hESCs were differentiated into alpha-fetoprotein (AFP)-producing endodermal cells, and second, the selected AFP-producing cells were then matured into functional hepatocytes by co-culture with a murine mesenchymal cell line.
Evaluation of the Artificial Basement Membrane and PseudoMatrix: We developed artificial basement membranes derived from human sources (rhLM-332, rhLM-511, and rhLM-111) in order to replace such xeno-materials, and thereafter assessed the adequacy of such artificial basement membranes for carrying out the undifferentiated culture of human ES cells.
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