成果報告書詳細
管理番号20120000000948
タイトル平成19年度~平成23年度成果報告「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発/微生物群のデザイン化による高効率型環境バイオ処理技術開発/バイオフィルム工学による微生物のデザイン化」
公開日2012/12/19
報告書年度2007-2011
委託先名国立大学法人北海道大学大学院地球環境科学研究院
プロジェクト番号P07024
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約本研究開発課題における「デザイン化」とは「複合微生物系を単純化してその要素を理解し、合理的に部分再構築して生物反応の効率化をはかる技術」を指す。研究開発は以下の3項目について推進した。
[項目1] 硝化槽におけるアンモニア酸化細菌群のデザイン化
 種々の材質固体を試した結果、アンモニア酸化細菌標準株(Nitrosomonas europaeaIFO14298:以下AOB)はケイ酸カルシウム(コンクリート)系担体に付着してバイオフィルムを形成した。また、AOBはバイオフィルムを形成すると浮遊細胞状態にくらべてアンモニア酸化比活性が2-3倍高くなることを見出した。さらに、バイオフィルムではヒドロキシルアミン酸化還元酵素遺伝子が高発現して、アンモニア酸化活性が上昇することをつきとめた。以上の結果は、AOBが活性汚泥中でフロック(無担体バイオフィルム)を形成することによってアンモニア酸化活性を促進させている可能性を示唆する。
 AOBと従属栄養細菌との新たな共生関係を利用した活性促進技術の基盤開発を行なった。
活性汚泥から約100種類の従属栄養細菌を単離し、AOBと逐次混合培養することによってAOBへの影響を評価した。その結果、新規Rheinheimera属細菌 MR3が AOBのアンモニア酸化活性を約30%向上させることが判明した。MR3は脱窒活性を有さず(脱窒菌ではなく)、細胞外に分泌する非アミノ酸物質によって AOBのアンモニア酸化活性を促進することを発見した。
 以上の成果により、これまでブラックボックスであった硝化槽活性汚泥において中心的役割を果たす AOBの生理学的理解が進み、新しい微生物間相互作用が明らかとなった。
さらに、バイオフィルム化および特定細菌との共生という微生物群デザイン化技術を開発し AOBの活性を2-3倍上昇させることに成功した。
[項目2] 炭化水素分解細菌のデザイン化
 ナフタレン分解細菌をバイオフィルム化した後に原油汚染土壌に投入することによって、従来法では活性が全く失われてしまう約2ケ月後においても当初の約40%の活性を維持させることに成功した。さらに、バイオフィルム化によるナフタレン高分解活性持続性の要因が「高い環境耐性」と「高活性細胞の放出」であることを示した。
つまり、バイオフィルムが高性能な戦闘機をつぎつぎに発射する頑強な空母のような機能を果たすことを世界で初めて証明した。
[項目3] 植物-根圏細菌群のデザイン化
 本研究開発項目では水生植物と根圏細菌の共生作用を利用した根圏微生物群集のデザイン化を実現し、その有効性について実証することを目標とした。北大植物園より採取したウキクサ Lemna aoukikusa についてその根圏細菌を網羅的に調べた結果、環境汚染物質フェノールを高速分解すると同時に、ウキクサの成長を促進する、全く新規な細菌 Acinetobacter calcoaceticus P23を発見した。次に、除菌ウキクサにP23を再付着させてそのフェノール分解活性を調べた結果、野生ウキクサが約3日でフェノール分解活性を失ったのに対して、その活性は一週間以上持続した。またP23付着ウキクサの個体数が除菌ウキクサの約1.6倍(一週間後)増加していたことから、バイオマス燃料生産の効率化技術としても貢献できる可能性が示された。
以上により、光エネルギーを利用した省エネ型バイオ環境浄化技術と共に、浄化後に分解細菌をウキクサと共に現場から回収可能な安心安全な新技術基盤を開発した。
英文要約“Designing microorganisms” is a technology to reconstruct partially
natural complex consortia of microorganisms for streamlining biological reactions that are useful for water and soil treatment and purification.
[Item 1] Designing of ammonia oxidizing bacteria (AOB) in a nitrification tank.
Biofilms are structure of surface attached bacteria. It was found that
AOB formed significant biofilms on the surface of calcium silicate supports and expressed higher ammonia oxidizing activity than planktonic cells by two to three folds. This high activity was attributed to high expression of hydroxylamine oxidoreductase gene. These results suggest that AOB are capable of elevating cellular activities by forming flocks, non-support biofilms, in an activated sludge. Activated sludge is a complex microbial consortium that holds useful bacteria that increases AOB activities by unknown cell to cell interaction mechanisms. We successfully isolated Rheinheimera bacterium strain MR3 that increased AOB activity by 30%. It was revealed that MR3 was not a denitrifying bacterium and secreted new compounds that stimulate AOB activity. These results brought important basic knowledge for designing consortium of useful bacteria including AOB in activated sludge.
[Item 2] Designing hydrocarbon degrading bacteria. Most bacteria form biofilms in order to settle at comfortable environments and develop multicellularity. The biofilms confer on the constituent cells high resistance to environmental stresses. We successfully formed biofilms of naphthalene degrading bacteria and introduced them into naturally oil-contaminated soils. Activity of the cells in biofilms kept 40% levels even after two months when that of planktonic cells was almost extinct.
It was found that embattle biofims were capable of breeding and releasing
super-activated detached cells. These results demonstrated for the first time excellent efficacy of introducing biofilms formed by hydrocarbon degrading bacteria into oil-contaminated soils and its molecular mechanisms.
[Item 3] Designing useful rhizobacteria on plant roots.
Lemna aoukikusa, popular duckweed, was collected from botanical garden
in Hokkaido University. After extensive screening, a novel phenol degrading bacterium, Acinetobacter calcoaceticus P23 was isolated from the root surface of duckweed. P23 immediately attached and formed biofilms on L. aoukikusa. L. aoukikusa carrying P23 on the roots exhibited significantly high phenol degrading activity over a week under light. To our great surprise, L. aoukikusa carrying P23 showed growth rate at 1.6-times higher than rhizobacteria free L. aoukikusa.
This rhizobacteria designed duckweed system enables not only energy saving water purification technology but also enhanced production of biomass useful for bioenergy fermentation. Moreover, this system is a safe bioremediation technology because foreigner bacteria can be recovered with duckweed after degrading contaminants.
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