成果報告書詳細
管理番号20120000001131
タイトル平成20年度~23年度成果報告書 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術開発) 大腸菌によるイソプロパノール生産の研究開発
公開日2012/12/21
報告書年度2008-2011
委託先名国立大学法人九州大学 国立大学法人神戸大学
プロジェクト番号P07015
部署名新エネルギー部
和文要約件名:平成 20 年度~平成 23 年度成果報告書 「新エネルギー技術研究開発/バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術開発)/大腸菌によるイソプロパノール生産の研究開発」
本研究開発では、遺伝子組換えが容易な大腸菌を利用して、グルコースおよびキシロースからのイソプロパノール生産向上と多糖からイソプロパノールの直接発酵を目指したものである。
pH調整とグルコース逐次添加行うことで、生産株は667 mM (40.1 g/l)のイソプロパノールを培養開始60時間で生産した。イソプロパノールに蓄積に伴い、大腸菌の増殖阻害、イソプロパノール生産阻害が観察されたため、ガスストリッピング法を適応した。この結果、生産株は2,378 mM (143 g/l) のイソプロパノールを培養開始240時間で生産した。我々の知る限り、この値は最高の生産量であり、生産株は工業生産レベルの能力を持つことが示された。
イソプロパノール生産性の向上を目指して、目的生産物質と競合する代謝経路の削除を行った。ldhA、adhE、ptaの破壊株とこれらの組み合わせをイソプロパノール生産に適応したところ、ldhAまたはadhE 破壊株によるイソプロパノール生産で、生産性の向上が見られた。
針葉樹林モデル培地(グルコース85%、キシロース15%)を用いたイソプロパノール生産の向上を目指して、グルコース資化能を失ったキシロース選択株およびキシロース資化能を失ったグルコース選択株を作成した。キシロース選択株は、manZ、ptsG、gakを削除し、グルコース選択株はxylA を削除した。これらの株にイソプロパノール生産遺伝子を導入し、針葉樹林モデル培地を用いて混合培養したところ、親株にイソプロパノール生産遺伝子を導入した株と比較し、発酵時間が34時間から26時間へと大幅に短縮し、最大対糖収率も大きく向上し65.7mol%となった。
大腸菌へのバイオマス資化能の賦与を目指しして、セルラーゼ表層提示大腸菌の作成を試みた。βグルコシダーゼおよび表層提示アンカーをスクリーニングし、それらの組み合わせを最適化することで細胞表層におけるβグルコシダーゼ活性を70倍以上に向上させることができた。また、βグルコシダーゼ提示大腸菌を用いてセロビオースからの増殖能を評価したところ、グルコースとほぼ同等の増殖能が得られた。さらに、セロトリオースやセロペンタオースなどのセロオリゴ糖の資化能も有していることが明らかとなり、表層提示技術を用いて大腸菌にセロオリゴ糖資化能を賦与することに成功した。この技術を利用したβグルコシダーゼ表層提示大腸菌に、イソプロパノール生産プラスミドを導入した。その結果、大腸菌を用いて、初めてのセルビオースから物質生産(イソプロパノールの生産)することに成功した。
英文要約Title: Development of Technology for High-efficiency Conversion of Biomass and Other Energy/Development of Preparatory Basic Bioenergy Technologies/Research and Development to Improve Production through the Use of Engineered E. coli (FY 2008-2011)Final Report
To improve isopropanol production from glucose using E. coli, observation of growth inhibition by isopropanol, optimization of fermentation condition, and optimization of metabolic pathway were carried out.
Using a pH-controlled fed-batch culture with the intermittent addition of glucose, isopropanol producing strain produced 667 mM (40.1 g/l) of isopropanol after 60 h. As the accumulation of isopropanol drastically reduced production yields, a gas stripping recovery method was incorporated into the fed-batch culture system. Using this approach, the strain produced 2,378 mM (143 g/l) of isopropanol after 240 h with a yield of 67.4% (mol/mol). To our knowledge, this titer represents the highest level of isopropanol production by E. coli to date and suggests that the strain has a great potential for commercial fermentative isopropanol production.
In order to improve isopropanol production, we deleted the host pathways that compete with the isopropanol pathway for acetyl-CoA. The deletion of ldhA, adhE, pta, and the combination of these genes were applied to isopropanol production. A yield of isopropanol from glucose by the deletion of ldhA was better than that by the wild type and a titer by the deletion of adhE was better than that by the wild type.
To improve isopropanol production from conifer model medium mixed glucose (85%) and xylose (15%), strain which cannot use glucose or xylose was made. A strain deleted xylA cannot use xylosee from model medium and a strain deleted manZ, ptsG, and gak cannot use glucose. Using these strains for isopropanol production from the conifer model medium, the fermentation time using these strains is much shorter (26 h) than that using the ordinary isopropanol producing strain and maximum yield using these trains is 65.7 mol%.
Direct assimilation of cellobiose using beta-glucosidase (BGL)-displaying E. coli was demonstrated. Tfu0937 was successfully displayed on the E. coli cell surface and directly assimilated cellobiose as a carbon source. A novel anchor protein, Blc, which allowed for both N- and C-terminal fusion of Tfu0937. Tfu0937-displaying E. coli ATCC11303 was successfully grown on 0.2% cellobiose as almost the same rate of growth on glucose. Tfu0937-displaying E. coli ATCC11303 was also successfully grown on 0.2 % cellotriose, cellotetraose, cellopentaose and cellohexaose. To produce isopropanol from cellobiose, a strain using beta-glucosidase-displaying E. coli with isopropanol production plasmid had been created. As the result of optimization of medium, this strain consumed 5 wt/vol% cellobiose in 20 h and produced isopropanol with 27.1 mol/mol glucose%. This is the first demonstration of producing a target product from cellobiose by E. coli.
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