成果報告書詳細
管理番号20130000000388
タイトル平成21年度-平成24年度成果報告書 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術開発) 細菌のリグニン分解酵素遺伝子による植物細胞壁改変技術の開発
公開日2013/6/15
報告書年度2009 - 2012
委託先名国立大学法人東京農工大学 国立大学法人長岡技術科学大学 独立行政法人森林総合研究所 学校法人加計学園岡山理科大学
プロジェクト番号P07015
部署名新エネルギー部
和文要約リグノセルロースからのセルロースエタノール生産においては、原料に含まれるリグニンの存在が加工上の障壁の一つである。リグノセルロースのバイオ燃料の原料としての利用性向上をめざし、本事業では微生物の遺伝子を用いた遺伝子組換え技術を応用し、植物細胞壁に含まれるリグニンの構造改変を試みた。Sphingobium sp. SYK-6株はグラム陰性の土壌細菌であり、beta-アリールエーテル、フェニルクマラン(DCA)、ピノレジノールなど植物がリグニンを生合成する途上で生成する様々な芳香族化合物を分解する特異な性質を備えたバクテリアである。従って、SYK-6株が持つリグニン分解酵素遺伝子は、植物のリグニン生合成を改変する有用な遺伝子資源と考えられる。本事業においては、SYK-6株から既に単離されている酵素遺伝子であり、且つ植物のリグニン生合成の改変が期待される遺伝子を植物へ導入し、植物の細胞壁を改変することによりバイオ燃料の効率的な生産に資する新規の植物バイオマスを創出することを目的とした。また、同様の効果が期待される新規の遺伝子をSYK-6株から単離することも試みた。まず初めに、SYK-6株の遺伝子ライブラリーを探索することによりピノレジノールの変換に関わるピノレジノールレダクターゼ(PinZ)をコードする遺伝子(pinZ)を単離することに成功した。組換えタンパク質を用いた解析の結果、PinZはレジノール構造を持つリグニン二量体であるピノレジノールとラリシレジノールの両者を還元する能力を備えており、その比活性はこれまで単離された植物の同種の酵素と比較して格段に高い値を示した。次に、beta-アリールエーテルやピノレジノールと同様に主要なリグニン二量体であるDCAに着目し、その分解に関与する遺伝子の単離を試みた。SYK-6株によるDCAの代謝実験の結果、DCA分解はB環γ位炭素の逐次的な酸化から始まり、続いて起こるA環γ位炭素の酸化を経てスチルベン構造が生成した後、バニリンと5-ホルミルフェルラ酸まで分解されることが判明した。DCAからB環γ位の酸化によって2段階反応でカルボン酸を持つDCA-Cが生成すると考えられ、この2つの反応には多数のアルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの関与が明らかとなった。また、マイクロアレイを用いた解析からDCA-C のA環γ位の酸化に関与する2つのオキシダーゼ遺伝子を同定することに成功した。また、DCA-CCからDCA-Sへの変換に関わるデカルボキシラーゼの遺伝子も同定した。遺伝子組換えを用いたリグニン構造の改変に関しては、7つの遺伝子、9つの発現コンストラクトを作製し、シロイヌナズナ、交雑ヤマナラシ(ポプラ)、ユーカリ等に導入することに成功した。特に--アリールエーテル型の二量体に作用するligD遺伝子をシロイヌナズナと交雑ヤマナラシ(ポプラ)で機能発現させることに成功し、シロイヌナズナにおいては細胞壁に蓄積するリグニンの構造の変化をNMRにより確認した。また、ヒドロキシケイ皮酸CoAエステル類をヒドロキシベンズアルデヒド類へと変換するferB遺伝子をシロイヌナズナおよび交雑ヤマナラシへ導入することにも成功したが、導入した遺伝子によるリグニンの改変、細胞壁の糖化性の向上を判断するには至らなかった。
英文要約The resistance of lignin to breakdown is one of major obstacles in scarification of lignocelluloses for production of biofuels, such as cellulosic ethanol. In order to improve availability of plant cell walls as raw materials of the biofuels, we try to modify molecular structure of lignin in cell walls by genetic engineering with bacterial genes. Sphingobium sp. strain SYK-6 is a unique bacterium capable of degrading various lignin-derived aromatic compounds, including beta-aryl ether, phenylcoumaran, and pinoresinol, which are intermediates during the lignin biosynthesis in plants. Lignin-degradation genes for catabolism of these intermediates are ultimate tools for genetic manipulation of lignin biosynthesis in transgenic plants. In this project, we generated transgenic plants in which the genes isolated from SYK-6 for the dilignols and intermediates of monolignol were expressed. In addition, we also tried to isolate novel catabolic genes for dilignols, such as phenylcoumaran and pinoresinol from the bacterial strain. First of all, we identified the pinoresinol reductase gene, pinZ, from SYK-6. The pinZ gene product (PinZ) produced in Escherichia coli completely converted pinoresinol into lariciresinol. The specific activities of PinZ toward pinoresinol and syringaresinol were estimated to be 46 U/mg and 56 U/mg, respectively, in the presence of NADH. The activity of PinZ toward pinoresinol is significantly higher than that of pinoresinol reductase (AtPrR1) from Arabidopsis thaliana. In SYK-6 cells, a phenylcoumaran-type compound, dehydrodiconiferyl alcohol (DCA) is initially converted into DCA-C via the oxidation of the alcohol group at the gamma-position of the B-ring side chain. The resultant DCA-C is degraded to 5-formylferulate and vanillin through the oxidation of the alcohol group at --position of the A-ring side chain (DCA-CC), release of gamma-carbon (DCA-S), and the cleavage of linkage between C-alpha and C-beta. Multiple alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase genes involved in the conversion of DCA into DCA-C were identified. Based on the fact that the enzyme activity of SYK-6 to transform DCA-C was inducible, the oxidoreductase genes specifically induced in the SYK-6 cells grown in the presence of DCA were investigated by DNA microarray analysis. As a result, two genes were identified as the DCA-C oxidase genes. We also identified a novel type of decarboxylase genes involved in the conversion of DCA-CC into DCA-S. We prepared 9 gene constructs with 7 genes and generated several different transgenic lines of Arabidopsis, Populus and Eucalypts plants with them. Especially, in the Arabidopsis and Populus plants, functional expression of ligD gene for Cα-dehydrogenase, which acts upon beta-aryl ether compound, had been succeeded. Change in lignin structure in the transgenic plants with ligD gene has been evaluated by 2D-NMR analysis. Although gene for feruloyl-CoA hydratase/lyase, ferB, was also introduced into Populus plants, any improvement of enzymatic saccharification characteristics has not been observed in the transgenic plants.
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