成果報告書詳細
管理番号20130000001017
タイトル平成22年度-平成24年度成果報告書 グリーン・サステイナブルケミカルプロセス基盤技術開発 化学品原料の転換・多様化を可能とする革新グリーン技術の開発 非可食性植物由来原料からのグリーンポリマー製造基盤技術に関する研究(微生物機能を用いたポリマー原料製造基盤技術の研究開発)
公開日2013/11/13
報告書年度2010 - 2012
委託先名東レ株式会社 国立大学法人京都大学
プロジェクト番号P09010
部署名電子・材料・ナノテクノロジー部
和文要約本研究開発は、非可食性植物由来ポリマー原料(グリーンモノマー)としてセバシン酸等のジカルボン酸をターゲットとし、これらを効率的に製造するための新規微生物技術、分離膜を利用した革新バイオプロセス技術及び化学変換技術を開発することを目的として実施した。具体的には、下記3項目の研究を実施することにより、ジカルボン酸製造の基本プロセスを構築した。
(1) 非可食性植物由来ジカルボン酸製造プロセスのバイオ化基盤技術開発(京都大学)
 油脂高蓄積性糸状菌Mortierella alpina 1S-4株を対象に、セバシン酸の原料となりうるモノ、ジ不飽和脂肪酸生産株の化学変異による育種を行った。得られたΔ6ならびにΔ12不飽和酵素活性低下株では、それぞれ、リノール酸、オレイン酸が総脂質の35-50%にて蓄積した。また、菌体外に脂質を相分離あるいはエマルジョンの状態で漏出する変異株を数種取得した。そのうちの一株を、膜利用発酵技術・膜利用精製技術を検討すべく、東レ株式会社に提供した。
 モノ、ジ不飽和脂肪酸をセバシン酸生産の中間原料へと変換するオレイン酸水酸化酵素、リノール酸水和酵素を糸状菌Claviceps purpureaならびに乳酸菌Lactobacillus plantarumにそれぞれ見いだした。これらの酵素をクローニングしそれぞれMortierella alpinaならびに大腸菌にて機能的に発現させた。
 リノール酸水和酵素を発現する大腸菌を用い、リノール酸から10-ヒドロキシ-12-シス-オクタデセン酸(HYA)を生産した。約300 g/LのHYAを収率98%で得ることができ、これをセバシン酸への誘導研究のために東レに提供した。
 オレイン酸を水和、脱水素、バイヤー・ビリガ-酸化、エステル加水分解を経てセバシン酸へと変換する微生物触媒の基盤を構築した。
(2) 膜利用発酵プロセスによるポリマー原料発酵生産速度向上検討(東レ株式会社)
 Mortierella alpina 1S-4株を用い、精密ろ過膜を備えた発酵槽で連続培養を行った。膜により菌体を発酵槽内に留めて高密度培養を維持しつつ、主に炭素源からなる培地を供給しながらC/N比を高めた。その結果、高い油脂蓄積量(28g/L)と対糖収率の向上(14%)とを両立させることに成功した。
 京都大学により作出された油脂漏出変異株の膜利用連続発酵に向け、蒸気滅菌可能であり、かつ菌体阻止率と培地中油脂の回収率に優れる膜を選定した。
(3) 化学変換によるモノマーの製造法開発(東レ株式会社)
 京都大学で微生物変換による製造法開発が進んでいる水酸化脂肪酸HYA(10-ヒドロキシ-12オクタデセン酸)をセバシン酸に変換する化学プロセスを探索した。種々変換ルートを検討し、HYAを熱分解によって10-オキソデカン酸に誘導し、10-オキソデカン酸を酸素酸化によってセバシン酸に誘導する化学変換ルート見出した。HYAの熱分解、10-オキソデカン酸の酸素酸化は、いずれも良好な収率で反応が進行し、操作は非常に簡便である。以上の検討により、HYAを2段階でセバシン酸に変換する低環境負荷の基本プロセスを構築することに成功した。
英文要約This R&D project was conducted to develop innovative ground technologies to produce dicarboxylic acids used as monomers of nylon-type polymers from non-edible plant biomass. To accomplish this aim, following three studies were carried out.
(1) Development of fermentative production technologies for dicarboxylic acids. (Kyoto Univ.)
An oleaginous filamentous fungus Mortierella alpina was chemically mutated into mono- and di-unsaturated fatty acid producers. In the delta6-desaturase and delta12-desaturase defective mutants, the contents of linoleic acid and oleic acid reached 35 to 50% in total fatty acids, respectively. Furthermore, mutant strains producing lipids extracellularly in bi-phasic or emulsion forms were obtained, and one of the strains was send to Toray establishing continuous culture methods using filter separation system.
An oleic acid hydroxylating enzyme and a linoleic acid hydrating enzyme were found in a filamentous fungus, Claviceps purpurea and a lactic acid bacterium, Lactobacillus plantarum, respectively. These enzyme genes were functionally expressed in M. alpina and E. coli, respectively.
The hydratase-expressing E. coli transformant was used for 10-hydroxy-12-cis-octadecenoic acid (HYA) production from linoleic acid. About 300 g/L HYA was produced with 98% molar yield under optimized conditions and the resultant product was send to Toray for further chemical transformation into sebacic acid.
Basic microbial catalysts for transforming oleic acid to sebacic acid through hydration, dehydrogenation, Baeyer-Villiger oxidation and ester hydrolysis were developed.
(2) Development of highly productive bioprocess for lipid fermentation. (Toray Industries, Inc.)
A microfiltration membrane integrated fermentation reactor was applied to lipid fermentation of an oleaginous filamentous fungus Mortierella alpina. Mycelia were kept in high density by the membrane separation, and the C/N ratio was increased by the continuous feeding of carbon source. As the result, highly lipid content (28g/L) and yield (0.14g/g glucose) were compatibly achieved.
For the continuous fermentation using the extracellular lipid-producing mutant strains established by Kyoto Univ., some membrane was selected in the view of steam resistance, mycelia recovery and extracellular lipid permeability.
(3) Development of chemical process to produce dicarboxylic acids from fatty acids. (Toray Industries, Inc.)
A specially modified fatty acid HYA, which was produced by bioprocess at Kyoto Univ., was found to be converted to 10-oxodecanoic acid in high yield by pyrolysis. This compound was transformed efficiently to the targeted bio-monomer, sebacic acid, by a simple aerobic oxidation. By these studies, a basic methodology to produce sebacic acid by an environmentally benign two-step chemical process was developed.
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