成果報告書詳細
管理番号20130000000585
タイトル平成21年度-24年度成果報告書 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術開発) 遺伝子組換えによるバイオマスエネルギー高生産樹木の創生に関する研究開発
公開日2014/5/9
報告書年度2009 - 2012
委託先名国立大学法人東京農工大学 国立大学法人筑波大学 日本製紙株式会社
プロジェクト番号P07015
部署名新エネルギー部
和文要約 近年、地球規模の環境劣化が大きな社会問題となっている。本事業においては、不良環境においてもバイオマス生産性の高い樹木を創出することにより、バイオマスエネルギーの生産と地球環境の保全を同時に行うことを目指して研究開発に取り組んだ。自然界には、このような問題を解決する能力を持った樹木は知られていないため、遺伝子組換えの手法を用い、成育が早いため広く事業植林されているユーカリの改良を試みた。中でも、耐塩性が高いことが確認されているユーカリ・カマルドレンシスを対象樹木として選定し、耐塩性遺伝子の導入により野生型に比較してより耐塩性に優れた系統を作出・選定することにより、目標としたレベルで系統の選定を達成することができた。
 3種類の耐塩性遺伝子(マングリン、コリンオキシダーゼ(codA)、RNA結合タンパク質(RBP))を用いて組換えユーカリを作出した。培地での耐塩性、遺伝子の発現、目的物質の蓄積等により選定し、閉鎖系の栽培室において300 mMのNaCl水溶液を用いた短期間投与での耐塩性を確認した。さらに、不良環境のモデルとして塩害地を想定する手法を検討し、75 mMのNaCl水溶液でEC値を安定に保持しながら、より長期間のバイオマス生産性を調査した。その結果、野生型に比較して2割以上バイオマス生産性の高い系統を選定することができた。さらに、一部の系統において耐乾燥性も付与されていることを確認した。
 より高機能な組換え体を作出するために、まずGUS遺伝子を用いてプロモーターとターミネーターの検討を行った。基礎ベクターを導入した組換え体の分析により、HSPターミネーターを用いることで、従来のNosターミネーターに比較して発現の高い系統が得られる可能性を見出し、耐塩性遺伝子と組み合わせてユーカリへの導入を行った。その結果、codA遺伝子組換え体では目的物質であるグリシンベタインの高蓄積を確認した。またRBP組換え体ではノーザン分析により発現の高い系統を確認した。さらに、かずさDNA研究所に依頼して実施した次世代シークエンサーデータより、目的のRNAの発現強度はHSPターミネーターを用いた系統で高いことを確認した。
 また、本事業では耐塩性向上効果をもたらす、新しいタイプの耐塩性関連遺伝子の探索とその機能解析に関する研究を進めてきた。このうち、マングリンは既にシャペロン様の機能を有することが確認されている。本事業で着目したアイスプラント由来の葉緑体型RNA結合タンパク質はRNAシャペロンとして機能していることを確認した。また、本プロジェクトで新たに注目したイグサ由来のプロリンリッチタンパク質は細胞外でプロリン貯蔵物質として機能し、ストレス時に植物細胞内のプロリン含量を増大させる役割を担っているものと考えられた。
 さらに、前述の3種類の遺伝子組換えユーカリについて、特定網室における耐塩性特性評価試験および生物多様性影響評価試験を行った。その結果、いずれの耐塩性遺伝子組換えユーカリ系統においても、低中程度の塩存在下でのバイオマス生産量が非形質転換体と比較し、2割以上改善されることが確認された。また、本研究に用いたいずれの系統においても、遺伝子導入による生物多様性に対する負の影響の増大は認められなかった。
英文要約Title: New Energy Technology Development. Development of Technology for High-Efficiency Conversion of Biomass and Other Energy. R&D of Genetic Engineering to Produce Trees with High Biomass Energy Productivity

The environmental change, subsequent degradation of natural resources and the future limitation of fossil fuels because of skyrocketing uses at newly developing regions, have been the global concern. Forestation is considered to be an effective approach to mitigate these constraints because it can preserve the environment and supply raw materials which can be converted in to renewal industrial goods at the same time. In response with the environmental devastation to the vegetations, it is important to breed environmental stress-tolerant and fast-growing trees. Our purpose is to produce trees with high biomass energy productivity that can grow on marginal lands.

1. Development of Harsh-environment-compatible Technology
To increase biomass production under highly stressed environment conditions, transgenic eucalypts that induce salt-tolerant gene(s) (mangrin, coline oxidase [codA] and RNA binding protein [RBP] ) have been produced and selected on the salt medium.These lines were evaluated by salt-tolerance in a growth room with 300 mM NaCl. The salt-tolerant lines were selected from three types of transgenic lines. To compare the biomass production, 75 mM NaCl solution was used and tries to keep EC level. We chose the lines which show 20% of an amount of growth as compared with the wild type.

2. Studies on Developing Highly Functional Trees
We compared two terminators (HSP and NOS) using the GUS gene. Higher GUS expressions were observed in the eucalyptus shoot with HSP terminator. To produce highly stress-tolerant trees, the vector containing codA genes with HSP terminator introduced into eucalyptus. The glysinebenaine accumulation was determined and higher content were observed in the HSP terminator lines.

3. Research on Mode of Action and Comparative Study of Salt-tolerance Genes
To enhance the salt tolerance of Eucalyptus, screening of genes responsible for the salt tolerance was performed from a mangrove plant, ice plant, and rush. Mangrin, isolated from a mangrove plant showed chaperone-like function. Chloroplast RNA-binding protein showed RNA chaperon like function. Proline-rich protein isolated from rush was found to be a proline storage material. These genes can be used to enhance the salt tolerance of eucalyptus

4. Development of Evaluation Methods on GM Trees in Special Netted-house and Field Testing.
We have conducted assessment of the early-stage selection processes of the transformants, in-depth characterization of the salt stress tolerance and environmental risk analysis as the part of abiotic-stress tolerance breeding. These results of the assays of salt tolerance shown biomass production of the transgenic eucalyptus lines were 20% higher than that of the non-transgenic lines in simulated salt-land condition. In addition, we assessed the impact of the transgenic eucalyptus lines for soil microorganism communities and allelopathic activities of leaves, and showed no significant differences among non-transgenic and the transgenic lines.
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