成果報告書詳細
管理番号20130000000596
タイトル平成21年度-平成24年度 成果報告書 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発(先導技術開発) エネルギー植物の形質転換技術及び組換え植物栽培施設での栽培技術の開発
公開日2014/6/14
報告書年度2009 - 2012
委託先名国立大学法人筑波大学 国立大学法人千葉大学
プロジェクト番号P07015
部署名新エネルギー部
和文要約本研究開発では、遺伝子組換え技術を利用した食糧と競合しないエネルギー植物の創製に貢献する、品種改良法及び栽培法に関する以下の研究開発を行った。
1)スーパーアグロバクテリウムの高度化に関する研究開発(担当:筑波大学)
従来型のスーパーアグロバクテリウムの利便性と性能の向上を目指し、次世代型のスーパーアグロバクテリウムに取組んだ。アグロバクテリウムのvirD1遺伝子プロモーターを用い、3つの遺伝子をタンデムに繋いだものを2セットアグロバクテリウムゲノム上に導入させることによりACCデアミナーゼ活性の向上と安定化に成功した。遺伝子導入を抑制する他の因子の探索にも取組んだ。先行研究からアグロバクテリウムの感染時に植物からGABA(γ-アミノ酪酸)が分泌され、これがアグロバクテリウムによる遺伝子導入を抑制することが示唆されていた。GABAとエチレンの遺伝子導入阻害機構は異なるので、二つの遺伝子をアグロバクテリウムへ付与することにより、遺伝子導入の促進をさらに高められることが期待できた。そこでGABAを分解する酵素を生産するgabT遺伝子をアグロバクテリウムへ導入し、GabT活性をアグロバクテリウムへ付与することに成功した。当初目標としていたACCデアミナーゼ遺伝子の高発現および安定化という目標を達成し、GABA分解能を持つアグロバクテリウムの開発という新規な研究を展開することができたので、100%以上の達成度といえる。
2)スーパーアグロバクテリウムの効果的利用技術に関する研究開発(担当:千葉大学・筑波大学)
イネ科のエネルギー植物として期待されているエリアンサス、ネピアグラス、ギニアグラス、ソルガムにおいて培養系の開発を目指した。このうち、エリアンサス、ギニアグラス、ソルガムについては、安定した再分化系を構築することができた。エリアンサス、ソルガム共に開発した培養系を基盤にして、スーパーアグロバクテリウムを利用して遺伝子導入法の検討を行っている。ソルガムでは、アグロバクテリウムとの共存培養後、一過的な遺伝子発現および再分化が認められたが、サザンブロット解析等を行なっておらず、形質転換の確認には至っていない。再分化効率は本研究で開発したスーパーアグロバクテリウムにより向上することが認められた。エリアンサスについては、安定した形質転換体カルスの作出には成功し、再分化も出来る見込みである。また本研究で作出した次世代型スーパーアグロバクテリウムの効果を検証することもできたので、目標の75%を達成していると判断する。
3)エネルギー植物の組換え植物栽培施設での栽培技術の研究開発(担当:筑波大学)
ソルガムとエリアンサスの非組換え体を閉鎖系の栽培室で栽培したのち、土に移植してから栽培室で順化・栽培し、その後特定網室において栽培することに成功した。エリアンサスについてはその後、隔離ほ場でも栽培試験を行った。2種類のエリアンサス Erianthus arundinaceusとE. ravennaeの非組換え体を材料にして、組換え植物栽培施設(閉鎖系栽培室、特定網室)内での栽培技術の研究を行った。E. arundinaceusはE. ravennaeと比較してDNA含量が3倍であり六倍体であることを明らかにした。種子繁殖が難しいとされているエリアンサスは特定網室内において株分けによる増殖法の開発を試み、株分けによる連続増殖技術を開発することに成功した。E. arundinaceusの増殖率は1ヶ月で1株の増殖が可能なE. ravennaeより高く、25日に1株以上増殖出来ることが判明した。これにより、特定網室で組換えエリアンサスにおける導入遺伝子の安定性評価期間(5世代)に要する期間は、E. arundinaceusで約4ヶ月であることが判明した。続いて、非組換えエネルギー植物を使って、筑波大学遺伝子実験センターの隔離ほ場で比較栽培試験を行った。最大葉長はE. ravennae、E. arundinaceus共に差がないが、分けつ速度はE. ravennaeの方が早かった。一方で乾燥重量は、E. arundinaceusの方がE. ravennaeよりも有意に重く、バイオマス生産が大きいことが示された。土壌成分の吸収量を栽培の前後で比較したところ、2種類のエリアンサスで同程度であった。これは、肥料の消費が2種類で同程度であると言うことが期待できる。同程度の肥料投与で大きなバイオマス生産ができるのでE. arundinaceusの方がエネルギー植物として有望である考えられた。開花特性も調べ、エリアンサスは2種類ともつくば市で越冬することも明らかにした。以上により、エリアンサスの隔離圃場でのつくば地域での栽培特性の一端が明らかになった。非遺伝子組換えエリアンサスを用いて、特定網室、隔離ほ場での栽培特性について有効な情報を蓄積することができたので、達成度は100%といえる。
英文要約This study also aims to develop cultivation and assessment technologies for energy plants in GMP facilities through the following approaches. 1) Improvement of the super-Agrobacterium: To improve the ability of the super-Agrobacterium in genetic transformation, ACC deaminase expression was increased. We used the virD1 promoter because it exhibited the highest gene expression during co-cultivation. We attempted to integrate the ACC deaminase gene into the Agrobacterium genome to facilitate the development of a super-Agrobacterium. We also constructed two new bacterial strains. One strain has two operons containing three segments of the ACC deaminase gene under the control of the lacZ promoter or virD1 promoter. A second Agrobacterium strain that exhibits GABA degradation activity was also developed. GABA is normally released from plant cells during co-cultivation, which inhibits Agrobacterium-mediated gene transfer. Therefore, we introduced the gabT gene into the super-Agrobacterium, causing the GABA-T enzyme to degrade GABA into glutamic acid. In a comparison of these four strains using Erianthus ravennae, the Agrobacterium strain with the gabT gene exhibited the highest efficiency for gene transfer, at 2.5 times higher than that of the original super-Agrobacterium. By increasing the ACC deaminase expression, the virD1 promoter led to a gene transfer efficiency 1.5 times higher than that of the original super-Agrobacterium. The Agrobacterium strain containing two operons with the virD1 promoter exhibited the same level of gene transfer as the original super-Agrobacterium. We are currently verifying the efficacy of this new super-Agrobacterium strain in the transformation of energy plants. 2) Effective utilization technology for the super-Agrobacterium: We aim to develop in vitro culture systems and genetic transformation techniques for energy plants, including Erianthus, Miscanthus, Pennisetum, Panicum, Sorghum, and Saccharum. Somatic embryogenesis and plant regeneration methods have been established for Erianthus, Miscanthus, Pennisetum, Panicum, Sorghum, and Saccharum utilizing leaf segments and seeds. However, the regeneration efficiency of some species remains insufficient. In future work, we will further improve the regeneration system for energy plants and develop high-throughput genetic transformation methods based the newly developed super-Agrobacterium strains. 3) Cultivation technology for energy plants in GMP cultivation facilities: To develop cultivation and assessment technologies for GM energy plants in GMP facilities using non-transformed plants of E. ravennae and E. arundinaceus, both an acclimatization method for in vitro plants and a vegetative propagation method after acclimatization in a containment culture room and a screened greenhouse have been established. The energy plants were grown in a closed GMP field from May to November in 2012. E. ravennae flowered and produced seeds; however, E. arundinaceus did not. Based on dry weight, E. arundinaceus was heavier than E. ravennae. The absorption of nitrogen, phosphoric acid, and potassium was the same for both Erianthus species. Although the biomass production of E. arundinaceus was higher than that of E. ravennae, the absorption was the same. Therefore, E. arundinaceus is superior to E. ravennae with respect to biomass production. Through these studies, important information will be provided for the handling of GM energy plants in GMP facilities.
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