成果報告書詳細
管理番号20130000001056
タイトル平成24年度成果報告書 新エネルギーベンチャー技術革新事業(バイオマス) 様々な発酵阻害物質を含むバイオマス糖液に対する酵母発酵能を向上させていく技術開発
公開日2014/6/11
報告書年度2012 - 2012
委託先名株式会社ネオ・モルガン研究所
プロジェクト番号P10020
部署名技術開発推進部
和文要約件名:平成24年度成果報告書 新エネルギーベンチャー技術革新事業(バイオマス) 様々な発酵阻害物質を含むバイオマス糖液に対する酵母発酵能を向上させていく技術開発

高いエタノール生産能を持つS.cerevisiae にキシロース代謝能を持たせることで、キシロースを含むバイオマス糖液からのエタノール生産性を高める試みが世界中で行われている。バイオマス糖液には、酢酸、フルフラールをはじめ、様々な発酵阻害物質が含まれており、キシロース代謝の阻害が引き起こされる。本業務の目的は、我々の保有する遺伝子組換え体、すなわち強いキシロース代謝能を持たせるために必要な5つの遺伝子(XYL1、XYL2、XKS1、TKL1、TAL1 )を導入して作製したS.cerevisiaeを様々な発酵阻害物質を含むバイオマス糖液に対しても速やかな発酵ができるように育種することにある。
はじめに、発酵阻害物質として最も強い影響をあたえる酢酸に対する耐性付与を試みた。酢酸濃度が3.0g/L-4.5g/Lとなるキシロース培地を調製し、5つの遺伝子を導入した親株(X42、X68)に変異処理を行い、これら変異体の中から、調製した培地において生育が良好である酢酸耐性株を得た。得られた酢酸耐性株の中から、エタノール生産性に優れた株を選抜した(X42R6、X68R3)。さらに、選抜した株(X42R6、X68R3)に変異処理を行い、酢酸濃度を上げた(4.0g/L-5.5g/L)キシロース培地において、生育が良好である酢酸耐性株を得た。これら耐性株の中から、エタノール生産性に優れた株を選抜した(X42R101、X68R134)。
次に、キシロース代謝能を高めることで、発酵阻害物質全体からの阻害に対して、強い耐性を示すような株の取得を試みた。キシロースと薬剤を含む培地を調製し、育種株(X42R101、X68R134)から薬剤耐性株を得た。これら薬剤耐性株の中から、発酵阻害物質を含む培地(60g/L グルコース、40g/L キシロース、3.5g/L 酢酸、1.0g/L フルフラール)において、キシロース代謝能とエタノール生産性に優れた株を選抜した(M12F1、R34F3)。M12F1におけるエタノール収率は、24時間後に82.0%、52時間後に84.6%となった。
最後に、バイオマス糖液におけるM12F1の発酵能を確認した。バイオマス原料であるエリアンサス、イナワラ、ユーカリに対して、アルカリ、爆砕、熱水処理を実施し、糖化酵素により、様々な発酵阻害物質を含むバイオマス糖液を調製した。原料と前処理方法の違いから、酢酸濃度も、0.3-5.6g/Lと異なるものとなった。酢酸濃度が3.5g/L以下の糖液であれば、M12F1は速やかな発酵ができ、エタノール収率も糖液によっては24時間後に80%を超えていた。また、バイオマス糖液においても同様な発酵能を発揮することができた。酢酸濃度が4.0g/Lを超える糖液では発酵阻害が認められたが、pHを上げることで発酵阻害の影響を大きく減らすことができた。
開発した酵母は、バイオマス糖液においても十分な性能を発揮できることから、今後は、我が国のプラントメーカーのほか、セルロース系原料を用いたエタノールの製造技術開発を行っている海外メーカーなどにも、開発酵母の利用価値を積極的に提案し、実製造につなげ、最終的にCO2削減に大きく貢献していきたい。
英文要約Title:Improvement in the yeast fermentation productivity in the biomass hydrolysate with varying inhibitor FY2012 Final Report

There has been a global trend to improve the ethanol production by implementing xylose assimilation capability to the high ethanol producing S. cerevisiae for the use of xylose-based biomass hydrolysate. Although there has been an issue that biomass hydrolysate contains inhibitor such as acetic acid and furfural, which inhibit the xylose assimilation.
The objective of this project is to improve the engineered strain with 5 genes (XYL1, XYL2, XKS1, TKL1, TAL1), which is indispensable for the xylose assimilation capability, to achieve the prompt fermentation capability even with the biomass hydrolysate with various inhibitors.
First, we started from achieving a tolerance to acetic acid. We used two mutant (X42, X68), inoculated in xylose medium with the concentration of acetic acid from 3.0g/L-4.5g/L. From this medium we have selected the pool of strain with the positive growth, which is high acetic acid resistant strain.
From this pool of strain, we screened the strain with high ethanol productivity (X42R6, X68R3). Again we repeated this procedure for one more round with the higher acetic acid concentration for the higher resistant strain (X42R101, X68R134).
Second, we screened the strain that has a tolerance to multiple inhibitors among the biomass hydrolysate. For this project, we prepared the synthetic xylose medium with each inhibition drug and screened the pool of multiple inhibitor resistant strain based on two mutants (X42R101, X68R134). From here, we then screen the high ethanol producing strain in synthetic medium with inhibitor (Glucose: 60g/L, Xylose: 40g/L, Acetic acid: 3.5g/L, Furfural: 1.0g/L) to achieve the strain with both high ethanol productivity and xylose capability (M12F1, R34F3). The yield in M12F1 was 82.0% after 24 hours and 84.6% after 52 hours.
At last, we have used those selected strain M12F1 in biomass hydrolysate to confirm the fermentation capability. We prepared the variant biomass hydrolysate with the combination of Erianthus, Rice straw, and Eucalyptus with the pretreatment method of Alkylation, explosion, and hydrothermal treatment and the additional enzyme treatment. Due to the difference in the feedstock and the pretreatment method, the concentration of acetic acid has diversified from 0.3-5.6g/L. M12F1 was able to ferment promptly, with the hydrolysate with acetic acid below 3.5g/L. Ethanol yield has exceeded 80% within 24 hour in some cases.
This result indicates that the strain were able to achieve the similar fermentation ability in the hydrolysate. Despite of some fermentation inhibition with the acetic acid above 4.0g/L, we were able to mitigate those effects by controlling the pH concentration.
We are currently aspiring to propose our improved the strain, not only to the Japanese plant manufacture but to U.S. based ethanol producer, who is keen to develop the cellulosic ethanol process. Hence we contribute to the future CO2 reduction.
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