成果報告書詳細
管理番号20140000000285
タイトル平成22年度-平成25年度成果報告書 バイオマスエネルギー技術研究開発 戦略的次世代バイオマスエネルギー利用技術開発事業 (次世代技術開発) 非可食バイオマス由来混合糖からのバイオブタノール生産に関わる基盤技術開発
公開日2014/7/15
報告書年度2010 - 2013
委託先名バイオブタノール製造技術研究組合 国立大学法人東京工業大学
プロジェクト番号P10010
部署名新エネルギー部
和文要約件名:平成22年度-平成25年度成果報告書「バイオマスエネルギー技術研究開発/戦略的次世代バイオマスエネルギー利用技術開発事業(次世代技術開発)/非可食バイオマス由来混合糖からのバイオブタノール生産に関わる基盤技術開発」
本研究開発は、既存のアセトン・ブタノール・エタノール(ABE)発酵法とは全く異なるコンセプトに基づく革新的バイオプロセス「増殖非依存型バイオプロセス」をコア技術として、ブタノール生合成系遺伝子組換え株の改良研究により、非可食バイオマス由来の混合糖(C5+C6糖類)を出発原料とした“高効率バイオブタノール生産基盤技術”の確立を目指したものである。
1. 増殖非依存型バイオプロセスによるバイオブタノール生成技術の開発
(1)高機能酵素をコードする遺伝子の探索・改良:acetohydroxyacid synthase(AHAS)は、バリン、ロイシン、イソロイシンにより強いフィードバック阻害を受ける事が知られている。これを解除するため、代謝拮抗物質(アナログ)の耐性株取得を行い、バリン存在下においても高い活性を保持する変異型AHAS遺伝子を取得した。また、ブタノール生合成系の代謝中間体に高い基質特異性を示す遺伝子として、乳酸菌の2-keto acid decarboxylase(KDC)及び大腸菌のisobutanol dehydrogenase(IDH)を選抜した。(2)細胞内酸化還元インバランスの解消:コリネ型細菌のacetohydroxyacid isomeroreductase(AHAIR)酵素遺伝子を改変し、NADPHよりもNADHに大幅に親和性が高まった変異型AHAIR酵素を創製した。また、混合糖からのブタノール生産時に生じる細胞内のNADH/NAD+のインバランスによる阻害を回避するために、解糖系酵素遺伝子の高発現と、変異型AHAIR酵素遺伝子の導入を行った結果、増殖非依存型バイオプロセスによる混合糖からのブタノール生産性が飛躍的に向上した。(3)副生経路の遮断:対糖収率を向上させるため、乳酸・コハク酸の副生経路遮断を行った。(4)「高濃度生産プロセスのための基盤技術開発」として増殖非依存型バイオプロセスと連続的なブタノール分離回収法の組み合わせの検討を行い、ブタノールの生物毒性回避による大幅な生産性向上を確認した。これらの技術統合により、非可食バイオマス由来混合糖からのブタノールへの変換率70%でのブタノール生成技術構築(回収を含む)し、目標であるSTY(Space/Time/Yield):3 g/L/h以上でのブタノール生成を達成した。
2. コリネ型細菌におけるRNA分解酵素による糖代謝制御機構の解析
mRNAの安定性は遺伝子発現に重要な役割を果たしている。大腸菌のRNase Gは解糖系酵素をコードするmRNAを特異的に分解し、RNase G欠損株では解糖系が昂進することが知られている。本研究開発では、大腸菌RNase Gの知見をもとにCorynebacterium glutamicumのRNase GホモログNCgl2281の機能を解析し、バイオブタノール生産性の向上に寄与することを目的とした。NCgl2281欠損株では、糖や酢酸の代謝に重要なグリオキシル酸経路のイソクエン酸リアーゼをコードするaceA mRNAが安定化し、イソクエン酸リアーゼが過剰発現していることを見出した。NCgl2281はaceA mRNAの3’-非翻訳領域(UTR)を認識して分解することを明らかにした。aceA mRNA 3’-UTRをイソブタノール生合成系酵素のmRNAに接続することにより、野生株と比べて3-5倍の過剰発現を達成した。これらの知見をもとに、aceA mRNAの3’-UTRとNCgl2281欠損株を利用したイソブタノール生合成系酵素過剰発現系を提案した。
英文要約Title: Research and Development of Technology for Biomass Energy Conversion / Strategic Development for Next-generation Technology for Utilization of Biomass Energy / Development of Biobutanol Production Fundamental Technology from Non-edible Biomass Resources (FY2010-FY2013) Final Report
We conducted research and development on “fundamental technology of high-efficiency butanol production” from mixed sugars (C5 and C6) derived from non-edible biomass resources. Our biobutanol production process, which is distinct from the Acetone-Butanol-Ethanol (ABE) anaerobic-fermentation of C. acetobutylicum, employs an innovative growth-independent bioprocess as its core technology.
1. Metabolic engineering of C. glutamicum for butanol production
Promotion of research and development of high biobutanol-producing strains ; (1) Search for enzymes with high substrate specificities and high enzymatic activities : Acetohydroxyacid synthase (AHAS), which catalyzes key reactions in the biosynthetic pathways of valine, isoleucine, and leucine, is feedback-regulated by the respective end products of these pathways. We isolated a mutant-type AHAS enzyme from an analog-resistant mutant, which maintained high activity in the presence of valine. We also selected 2-keto acid decarboxylase (KDC) from L. lactis and isobutanol dehydrogenase (IDH) from E. coli as high substrate specificity and high enzymatic activity enzymes for the pathway for butanol production. (2) Conversion of cofactor requirement for the adjustment of the redox balance : The butanol production from mixed sugars caused intracellular redox imbalance. To address this redox imbalance, we used a NAD-preferring mutant acetohydroxyacid isomeroreductase (AHAIR) and overexpressed select glycolytic genes. (3) Elimination of by-product formation pathway in butanol production : To minimize synthesis of the major by-products, lactate and succinate, we disrupted ldhA and ppc genes. (4) The possibility of employing organic solvent as an extraction solvent to reduce end-product inhibition and to enhance butanol productivity in growth-arrested bioprocess was evaluated using oleyl alcohol as the butanol extractant. This technology integration attained a butanol yield of more than 70% and STY (Space/Time/Yield) of 3 g/L/h from mixed sugars from non-edible biomass resources.
2. Regulatory mechanism of sugar metabolism by RNase in Corynebacterium glutamicum
Regulation of mRNA stability plays an important role in gene expression. The E. coli RNase G is involved in the degradation of mRNAs encoding glycolytic enzymes. Consequently, glycolysis is accelerated in RNase G mutant cells. In this study, the characteristics of an RNase G homolog in an industrially important bacterium, Corynebacterium glutamicum, was investigated.
We found that the level of aceA mRNA encoding isocitrate lyase was approximately 3-fold higher in the NCgl2281 knockout mutant cells than in the wild type. 3’-RACE analysis showed that NCgl2281 cleaves the aceA mRNA in the 3’-untranslated region (3’-UTR). Overproduction of dihydroxy acid dehydratase involved in isobutanol biosynthesis was performed by using aceA 3’-UTR. These findings can be applied for overproduction of enzymes involved in isobutanol production.
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