成果報告書詳細
管理番号20120000000671
タイトル平成19年度-平成23年度成果報告書 「染色体解析技術開発 臨床診断用全自動染色体異常解析システムに対応したゲノムアレイの開発」(国立大学法人東京医科歯科大学)
公開日2014/8/28
報告書年度2007 - 2011
委託先名国立大学法人東京医科歯科大学
プロジェクト番号P06012
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約件名:平成19年度-平成23年度成果報告書 「染色体解析技術開発 臨床診断用全自動染色体異常解析システムに対応したゲノムアレイの開発」

<研究開発の内容及び成果等> 癌及び遺伝性疾患の個別化医療を実現するために、染色体微細構造異常に焦点をあてそれを解析するための診断用ゲノムアレイの開発と診断用全自動染色体異常解析システムの開発を目的とする。1)診断用ゲノムアレイの開発: <先天性疾患を診断するためのGDアレイの開発> 新規開発のDualハイブリ法を用いたGDアレイ(GD-700)による先天異常症ゲノムコピー数異常診断システムを確立し、GD-700の製造(富士フイルム株式会社)及び臨床検査受託(株式会社ビー・エム・エル)を開始した。また、GD-700の検査用途を不育症分野にも広げた。 ヒト全染色体を網羅する15,000種類のBACプローブを搭載した高精度ゲノムアレイWG15000解析システムを開発した。貼付するBACクローンの約10%(1500クローン)はFISH法で染色体マッピングした。WGA15000に加えて既に作製していた全ゲノム型BACアレイであるWGA4500、ならびに市販SNPアレイを用いて日本人健常者集団におけるCNVデータベースを作成しこれを公開した。<癌の染色体異常の解析と個別化医療での診断コンテンツの開発> 癌の個性診断用にミニアレイ(MCG Cancer Array-Mini)を開発した。本プロジェクトで開発する集中型および分散型自動解析装置に対応するものである。癌個性診断用MCG Cancer Array-Mini(33クローンセットおよび108クローンセット)を用いて各種癌でパフォーマンスを検証し、高精度検出能の確認および実用化の可能性を示した。食道扁平上皮癌(ESCC)、口腔扁平上皮癌(OSCC)、肝細胞癌、胃癌、大腸癌、骨軟部腫瘍を始め種々の癌種において詳細なゲノムコピー数解析を実施し、癌特異的ゲノムコピー数異常をランドマークに新規の癌関連遺伝子候補を同定するとともに、予後と相関する遺伝子(座)、ゲノム異常・を抽出した。その結果、ESCCの癌遺伝子としてSMYD2, YAP1、癌抑制遺伝子としてPCDH17, CRABP1、胃癌のびまん性増殖に関連するKLF12遺伝子などを同定した。
2)診断用全自動染色体異常解析システムの開発: <アレイCGH分散型全自動染色体解析装置の開発> ファイバー取り回しの改良による導光ロスの低減、測定励起波長の変更によるLED励起光量アップ、測定条件の最適化による光学系ロスの低減対策により、低シグナルスポット(濃度10nMまで)の検出に成功し、市販検出器より低コストでほぼ同等な検出感度を得ることができた。CNV既知の癌細胞株DNAを用いてアレイCGH検査の全自動化を評価した。その結果、“高度な増幅”、“増加”、“減少”などのCNVが検出され、正解率77%を得た。定量的解析精度、再現性等の課題はまだ残るもののアレイCGH検査の全自動化に目処を立てることができた。<集中型全自動染色体異常解析装置の開発> 標識・抽出・解析の三工程を並行して開発し、標識工程と抽出工程については平成21年度までに完成した。平成22年度は解析工程のスキャナーを改良した。全自動化システムを、既知染色体異常細胞のゲノムDNAを試料に評価を行いCNV検出が可能であることを確認した。今回開発の集中型全自動機がアレイCGHを評価できるレベルにあることを確認し、開発を完了した。
英文要約Title: Technical development of chromosome analysis; Development of genome array for the fully automated chromosome analysis system to assist clinical diagnosis for cancer and genetic disorder (FY2007-FY2011) Final Report

We established the diagnostic system to detect pathogenic copy number variations (CNVs) responsible for known multiple congenital abnormalities with mental retardation (MCA/MR) by modified array-comparative genomic hybridization (aCGH) using genomic disorder array (GD-700) in the clinical setting. In our system, the newly developed “Dual hybridization” was employed to detect copy number difference between normal diploid and test DNAs. Fujifilm Co., Ltd. and BML initiated the commercial production of GD-700 and the clinical testing for patients with MCA/MR in October 2009, respectively. A high-density array containing 15,000 BACs (WGA15000) was constructed, and “MCG Cancer Array (CA)-Mini” harboring 108 BACs was constructed as a diagnostic tool for personalized cancer medicine. Using two types of arrays (WGA-15000 and -4500) and SNP array (HumanOmniExpress), we analyzed 100 Japanese trios of parents and one child, and constructed CNV database of healthy Japanese. Using GD-700 and WGA-4500, two-stage screening was performed in patient with congenital disorders, whose karyotypes were normal according to conventional cytogenetics. The first screening detected pCNV in 69 of 646 cases (10.7%), whereas the second screening of the 515 cases negative in the first screening detected pCNVs in 61 cases (11.8%). Multiple genomic loci with copy number alterations associated with poor prognosis and/or recurrence of the respective cancers have been identified in various types of cancers including esophageal and oral squamous-cell carcinoma (ESCC and OSCC), renal cell carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, lung cancer. Cancer-related genes have been also identified from genomic regions with copy number aberrations, including PCDH17, SMYD2, CRABP1 and YAP1 in ESCC. Some of those are optimal biomarkers or candidate molecular targets for personalized cancer medicine. For the development of “point of care” analyzer to be used mainly in a hospital laboratory, we have established the fully-equipped automated analyzer consisting of the genomic hybridization module, the pretreatment module and the detector by the improvement for a recovery of DNA, and a noise in background signal as well as Coefficient of Variation (CV) in BACs loaded on a mini-array. We evaluated the detection-power for CNVs for clinical specimens in FY2010. For the development of high-throughput analyzer to be used in centralized clinical reference laboratories, we have improved the uniformity in a hybridization process, the signal-noise ratio and accuracy during scanning process, the User-Interface Software aiming at a superior handling performance in operations for the analyzer, and the process to prepare a control DNA suitable for “Dual hybridization” protocol in addition to the development of a new software. The resultant prototype (ver.3) of the fully-automated analyzer evaluated and confirmed to detect CNVs precisely with genomic DNAs prepared from clinical samples in FY2010.
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