成果報告書詳細
管理番号20120000001227
タイトル平成20年度-平成23年度成果報告書 「創薬加速に向けたタンパク質構造解析基盤技術開発」(ATP感受性カリウムチャネル制御機構解明に向けた基盤技術開発)
公開日2014/8/27
報告書年度2008 - 2011
委託先名国立大学法人京都大学
プロジェクト番号P08005
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約創薬加速に向けたタンパク質構造解析基盤技術開発
「ATP感受性カリウムチャネル制御機構解明に向けた基盤技術開発」
血中の高密度リポタンパク質(HDL:善玉コレステロール)の濃度はアテローム性動脈硬化症の発症と逆相関する因子である。日本においても動脈硬化は糖尿病と並んで食生活の欧米化に伴い顕在化してきた問題であり、早期の対策が求められている。本研究では上記ATP感受性カリウムチャネルの発現精製において開発した手法を用いてHDLの形成において重要なABCG1の生化学的解析を行った。なお解析には創薬に直結する情報が期待できるヒト遺伝子を用いた。まずヒト培養細胞をもちいて大量発現を行い、界面活性剤の最適化により精製手法を確立した。ついで再構成した精製標品の生化学的解析からヒトABCG1が能動的な輸送体であり、脂質を選択的に輸送してHDL形成を行っている事を示唆する結果を得た。本研究は今後さらなる生化学研究はもちろんの事、特異的な阻害剤の探索にも有効であり、動脈硬化症をターゲットとした創薬のリード化合物発見につながる成果が期待できる。
英文要約Development of Basic Technology for Protein Structure Analysis Aimed at Acceleration of Drug Discovery Research
"Development of the fundamental technologies for the biochemical and structural analysis of ATP-sensitive potassium channel"
ATP-sensitive potassium (KATP) channel is a plasma membrane potassium channel which couples cellular metabolic levels to membrane potential. KATP channel is a hetero-octameric protein complex that comprised of the channel subunit Kir6.2 and regulatory subunit SUR1 in a 4:4 stoichiometry. Here, we report the large-scale production and purification of KATP channel complex using suspension-cultured human cells(Freestyle293 cells). A single expression plasmid containing both Kir6.2 and SUR1 was transfected using polyethyleneimine (PEI) into FreeStyle293 cells and the cells were cultured in a bioreactor. Formation of the KATP channel complex was analyzed based on the elution of GFP fused to the N-terminus of Kir6.2 in fluorescence size exclusion chromatography. Next, we expressed and purified human ABCG1, a key molecule for HDL generation. ABCG1 was successfully expressed in freestyle293 and retained functional dimer structure in most of tested detergents. Purified humanABCG1 showed robust ATPase activity as comparable as other transporter type ABC proteins. Moreover, the ATPase activity was significantly stimulated by the addition of sphingomyelin and cholesterol. Considering that the ATPase activity of ABC proteins are stimulated by the addition of transport substrates, our results suggest that humanABCG1 is an active transporter and prefers sphingomyelin and cholesterol.
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