成果報告書詳細
管理番号20120000001229
タイトル平成20年度-平成23年度成果報告書「創薬加速に向けたタンパク質構造解析基盤技術開発」(アクアポリンをターゲットとした分子標的創薬の基盤研究)
公開日2014/8/27
報告書年度2008 - 2011
委託先名学校法人慶應義塾
プロジェクト番号P08005
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約件名:平成20 年度-平成23 年度成果報告書 創薬加速に向けたタンパク質構造解析基盤技術開発「アクアポリンをターゲットとした分子標的創薬の基盤研究」

アクアポリンは主に細胞膜に発現し、細胞膜の水透過性を制御している。組織特異的に様々なアクアポリンが発現しており、アクアポリンと疾患や病態生理との関連も徐々に明らかになってきた。例えば、主に哺乳類の脳に発現しているアクアポリン4(AQP4)は、脳浮腫の病態と深く関わっており、脳浮腫に対する創薬ターゲットとして注目されている。これまでアクアポリン作用薬の開発は遅れをとってきた。しかしながら、その結晶構造に関する研究が進み、アクアポリンに対する分子標的創薬に対する期待も高まっている。そこで、本プロジェクトでは、アクアポリンの構造機能相関の観点から、1)ヒトAQP4の活性調節機構の研究、2)単一細胞レベルにおける細胞膜水拡散イメージング法の開発、3)分子動力学計算によるAQP1の水透過機構に関する研究を行った。バキュロウイルス発現系を用いてヒトAQP4を発現、精製し、リポソームに組み込んだ後、ストップトフロー法を用いて水透過性の測定を行なった。その結果、ラットAQP4と同様、亜鉛が可逆的にヒトAQP4の水透過性を抑制することを確認した。CARS(coherent anti-Stokes Raman scattering)顕微鏡と非常に速い溶液交換システムを用いることで、高い時間空間分解能で、単一細胞に於ける水拡散のライブイメージングを行なうことに成功した。更にこの方法を用いて、AQP4の発現レベルと水透過性の間に正の相関があることを確認することもできた。CARS顕微鏡を用いた水分子拡散イメージング法は、今後アクアポリンの活性調節機構に関する研究を進めていく上で非常に有意義な方法と思われる。
アクアポリンの単一チャネルレベルでの水透過性を測定する方法は開発されていない。そこで、我々は水銀によるAQP1の阻害機序を分子レベルで検討するため、分子動力学計算によるシミュレーションを行なった。40ナノ秒間の計算を行なったところ、23個の水分子がAQP1のポアを通過していたが、189番目のシステイン残基に水銀を結合させたモデル(Hg-AQP1)においては、40ナノ秒間にポアを通過した水分子はゼロだった。また、ポア近傍の構造を詳細に検討したところ、水銀の結合によりその構造が乱れ、水分子の通過が妨げられていることが確認された。本プロジェクトで用いた方法は、アクアポリンの構造機能相関を研究する上で非常に有用であることが確認された。また、本プロジェクトで得られた結果は、今後のアクアポリンをターゲットとした分子標的創薬に有用な情報を提供することができたと考えている。
英文要約Title:Study for structure-guided drug development against aquaporin-4. (FY2008-FY2011) Final Report

Auaporins (AQPs) are mainly expressed at the plasma membranes where they control water permeability. AQPs are distributed through whole body in tissue specific manner. Several aquaporin-related diseases have been identified. It has been accumulating that AQPs are involved in many pathological conditions such as brain edema. Therefore, AQPs are good targets for drug development, although no specific drug to AQPs is available, so far. Recent advantage in structural biology revealed atomic models of several AQPs, which may facilitate the drug development against AQPs. Here we investigate three projects regarding to structure-function relationship and regulation of AQPs; i) regulation of human AQP4, ii) development of live-imaging for water dynamics in the cells and iii) molecular mechanisms of mercurial inhibition of AQP1 by molecular dynamics simulation. We expressed recombinant human AQP4 in baculovirus system and purified, then reconstituted into proteoliposome. Osmotic water permeability was measured by stopped-flow apparatus. As observed in rat AQP4, we found that human AQP4 is also reversibly inhibited by zinc. An accurate and instantaneous method for measuring the Pd of a single HeLa cell has been established by using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy with a quick perfusion device for H2O/D2O exchange. To evaluate the roles of AQPs in diffusional water permeability, AQP4 fused with enhanced green fluorescent protein (AQP4-EGFP) was transiently expressed in HeLa cells. We confirm that H2O/D2O exchange rate in the AQP4-EGFP-HeLa S3 cells was much faster than control Hela cells. AQP4-mediated water diffusion was independent of the temperature but was depen- dent on the expression level of the protein at the plasma membrane. These results suggest the possibility of using CARS imaging to investigate the hydrodynamics of single mammalian cells as well as the regulation of AQPs. So far, no method is available to measure a single channel water conductance through aquaporin. Then we performed molecular dynamics simulation to investigate the molecular mechanisms how water molecules pass through the aqueous pore of aquaporin and how mercurial inhibits water conductance of AQP1. Our calculation revealed that 23 water molecules pass though aqueous pore of AQP1 monomer for 40 nS. Whereas, no water molecules pass through Hg-AQP1 (Hg was bonded to Cys189 residue), indicating that our model represents the experimental results. We next looked into the mechanisms behind the inhibition of AQP1 by mercurial. We found that the binding of mercurial to Cys-189 induces a local conformational change at the constriction region of the pore, thereby disrupting the water conductance instead of the occlusion of the pore by mercury itself. Taken together, we demonstrate a couple of novel approaches to examine structure -function relationship as well as regulation of AQPs, which facilitates a drug design against AQPs.
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