成果報告書詳細
管理番号20130000000334
タイトル平成23年度-24年度成果報告書 「ゲノム創薬加速化支援バイオ産業基盤技術開発 有用天然化合物の安定的な生産技術開発」(次世代天然物化学技術研究組合)
公開日2014/8/21
報告書年度2011 - 2012
委託先名次世代天然物化学技術研究組合
プロジェクト番号P11002
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約件名:平成23年度-24年度成果報告書 「ゲノム創薬加速化支援バイオ産業基盤技術開発 有用天然化合物の安定的な生産技術開発」

 放線菌は長い間、医薬、農薬開発の優れたリソースとして用いられて来た。また、近年のゲノム解析により、放線菌中には人類が未利用の有用物質生合成遺伝子が多数存在することが明らかになってきている。そこで、本研究開発では、次世代型天然化合物生産技術の開発を目的に、多種多様な化合物を対象に生合成遺伝子クラスターの取得、および異種発現生産について大規模な検証研究を通じて、有用天然化合物の安定生産技術の開発を行った。
 放線菌ゲノムはGC含有率が70%以上と極端な高GCゲノムDNAからなり、また繰り返し配列が多く存在することから、これまでギガシークエンサーの適用が困難であった。我々は種々の改良により、GS FLX 454の1ランで高精度にほぼ完全に放線菌ゲノムの解読が可能な手法を確立した。さらに、Illumina Miseqを用いたより安価かつ迅速に行える手法の確立にも成功し、今後のより大規模な展開が期待される。
  微生物二次代謝産物のうち、産業上重要なポリケタイド系化合物およびペプチド系化合物を重点的に生合成遺伝子クラスターの取得を行った。特にポリケタイド系化合物のうち、erythromycin、avermectin、FK-506、rapamaycinなど産業上重要なマクロライド系化合物は、I型PKSという100 kbpにもおよぶ巨大な生合成遺伝子クラスターで生合成される。このような巨大な遺伝子では、通常のほ乳類用技術とは一線を画すクローニング技術が要求される。これまで微生物二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの取得は、主にコスミドベクターが用いられてきたが、100kbpにも及ぶ巨大な生合成遺伝子クラスターの取得には、BAC(Bacterial Artificial Chromosome)ベクターを用いたクローニング技術が必須である。BACライブラリー調製法は、長いDNAを切断することなく取り扱うと言う点で高い技術が要求され、わが国ではほぼ行われていなかった。本研究開発では、放線菌ゲノムに最適化したBACライブラリー調製法の開発に成功し、120kbp程度の生合成遺伝子クラスターであればほぼ完全に取得が可能となった。生合成遺伝子クラスターのサイズによって、コスミド法およびBAC法を使い分け、合計67個の生合成遺伝子クラスターを取得した。巨大生合成遺伝子の代表例として、抗腫瘍および免疫抑制剤として臨床応用されているrapamycin(107kbp)が挙げられる。
  取得した生合成遺伝子クラスターを応用した化合物生産には、avermectinの工業生産に用いられているStreptomyces avermitilisを親株とし、幾つかの内在性遺伝子を破壊したSUKA株をメインの異種発現ホストとして使用した。本ホストは、内在性遺伝子の破壊により化合物前駆体の供給が外来性遺伝子に向けられるため、高い生産量で微生物二次代謝産物の生合成が可能となる。また、外来性遺伝子がゲノム中に組み込まれるため、安定に有用化合物の生産が出来る。この他に、S. albusおよびS. lividans(一部の生合成遺伝子を破壊したKASU1株)の合計3ホストに対して上記取得した67個の生合成遺伝子クラスターを導入し、化合物生産の有無、および生産量について検討した。その結果、3ホストの何れかで異種発現生産に成功した化合物は38個であり、その成功率は56.7%であった。世界的に、異種発現の成功率は10%以下と言われており、この成功率は群を抜いた数値であった。また、未発現の化合物については、プロモーター交換などの検討により、合計44個(成功率65.7%)について異種発現生産に成功している。論文報告での異種発現生産量はLCーMSで確認出来るレベルであることが多いのに対し、本研究開発では44個中29個の化合物が5mg/L以上の生産量で異種発現が確認された。
  以上のように、本研究開発で確立した、生合成遺伝子クラスターを利用した化合物の異種発現生産技術は、工業的に十分応用可能なレベルに達するものであると考えられる。
英文要約Title: Development of stable heterologous production method for industrially useful natural compounds. (FY2011-2012) Final Report

Actinomycetes has been used as an excellent source for medicines and agricultural products. Recent genomic analysis showed that there were many cryptic biosynthetic gene clusters for secondary products in actinomycetes. In this project, we developed a stable heterologous production system for industrially useful natural compounds.
The analysis of the genome sequence of actinomycetes is known to be difficult because of their extremely high G-C content (over 70%) and existence of repeated sequences. We succeeded in the highly accurate whole genome sequencing of actinomycetes by using a next generation sequencer GS FLX454. Further improvement brought us an inexpensive and rapid method using Illumina Miseq.
We tried to clone biosynthetic gene clusters of secondary metabolites like polyketides and peptides from actinomycetes. Of the polyketides, macrolides have long biosynthetic gene clusters of 70-110 kbp in length, known as type I PKS. Cosmid vectors had been employed for the cloning of biosynthetic gene clusters of microbial secondary metabolites, but cloning of long genes over 100 kbp required the technique of BAC (Bacterial artificial Chromosome) vectors. The preparation of BAC libraries required highly sophisticated techniques because their long DNA should not be sheared. However, we succeeded in developing a suitable method for actinomycetes genome. Now we can easily clone up to 120 kbp biosynthetic gene clusters by using this method. In this project, we cloned 67 biosynthetic gene clusters by using cosmid or BAC libraries, depending on their length. One example is the cloning of rapamycin biosynthetic gene cluster (107 kbp).
We used SUKA strains as the main host of heterologous expression system, which was derived from a strain of Streptomyces avermitilis utilized for industrial production of avermectin by deleting several endogenous biosynthetic genes. The deletion of endogenous biosynthetic gene clusters enabled the utilization of precursor of the secondary metabolites and resulted in high yield of the exogenous biosynthetic genes. In addition, the integration of the exogenous gene into chromosome enabled us a stable expression of the heterologous gene product. We used SUKA and two other host strains, S. albus and S. lividans, which are commonly used, and introduced the 67 biosynthetic gene clusters into the 3 host strains. As a result, 38 compounds (56.7%) were expressed in either strain. This ratio was outstanding because the highest reported expression ratio was about 10%. Finally we succeeded in the expression of 44 compounds (65.7%) by using promoter exchange. In addition, contrary to the yield in many reports, in which the product could only be detected by LC-MS, our production yield reached 5mg/L in 29 of 44 compounds.
In conclusion, we developed the world’s best technology for heterologous expression system using BAC vector cloning and SUKA strains as a host. This technology reaches industrially applicable level.
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