成果報告書詳細
管理番号20130000000514
タイトル平成22年度-平成24年度成果報告書 「基礎研究から臨床研究への橋渡し促進技術開発 橋渡し促進技術開発 腸管下痢症経口ワクチンの研究開発(一般財団法人阪大微生物病研究会、エムジーファーマ株式会社、国立大学法人東京大学)
公開日2014/8/8
報告書年度2010 - 2012
委託先名一般財団法人阪大微生物病研究会 エムジーファーマ株式会社 国立大学法人東京大学
プロジェクト番号P07022
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約均一CTB発現米を作出できる遺伝子CTBを組み込んだT-DNAベクターを使って、東大医科研と中央農業研究センターで確立したアグロバクテリウム共感染法を用いて、マーカーフリーCTB発現米(MF-CTB米)P5種子(55A株)を作出した。確立した55A株を種子バンクとして、臨床研究用MucoRice-CTBを東京大学医科学研究所2号館1階に設置されたGMP対応完全閉鎖型水耕栽培施設にて製造した。製造したMucoRice-CTBはトリプシン分解後のMS解析により、アミノ酸配列を決定した。MucoRice-CTBは、胚乳細胞特異的プロモータであるイネの13kDaプロラミンプロモータ下で胚乳細胞内に発現するように設計されているが、実際免疫電顕によりCTBはイネ胚乳細胞の2型蛋白貯蔵体のほか胚乳組織全体に認められた。MucoRice-CTBは無精製のままコメ粉末を投与するが、組換え米であるMucoRice-CTBのコメ主要アレルゲンの増加は観測されなかった。
 MucoRice-CTB原薬はコメぬか部分を削った95%精米粉末であるが、性状、水分含量、確認試験、異物検査、粒度試験、菌数試験、定量、生物学的活性からなる規格及び試験法を確立して原薬3ロットを試験し、適合したことを確認した。MucoRice-CTB製剤は結晶化セルロース等を賦形剤に加えた形のカプセル型で製造し、実際の臨床研究は東大医科研附属病院薬剤部でCTBとして1mgが投与できる量(約1g)を30mlの水に懸濁して投与する水薬を用事調製した。このため、水に懸濁した場合の懸濁後の6時間までの安定性(常温)を確認した。安全性試験は原体でのラット単回経口投与試験と反復投与試験(GLP対応)を三菱化学メディエンス社委託して実施した。単回毒性試験はMucoRice-CTBをCrl:CD(SD)ラットに空腹時の物理的な最大投与量600 mgの用量で投与し、被験物質に起因した毒性変化は何ら認められなかった。反復毒性試験は300mg の用量で投与し、2週間隔、5回投与したが、被験物質に起因した毒性変化は何ら認められなかった。薬理試験としてはマウスを用い、経口投与されたMucoRice-CTBは腸管からの取り込まれること、及びマウスの経口免疫でのコレラ毒素に対する防御免疫の誘導、並びにラットの経口免疫での中和抗体価の誘導等を確認した。
 これらの非臨床試験結果及び臨床試験プロトコールを東大医科研治験審査委員会に提出し、平成24年11月13日に承認を受け、12月3日から被験者の募集を開始した。平成25年1月7、8日から被験者説明会、スクリーニング試験を開始し、最終的に同意が得られた被験者から血液、糞便を集めた。これらの被験者から血清及び糞便のCTB特異的抗体を調べ、血清及び糞便中にCTB特異的抗体の両方を持たない被験者が選定された。このうち、本プロトコールの除外規定を適用し、最終的に同意が得られた19名の被験者が本臨床研究にエントリーした。試験は野生米から同様に賦形剤を加えて製造したプラセボ薬とMucoRice-CTB製剤の2群からなる単盲験試験で、2週間おきの4回経口投与で行われた。MucoRice-CTBはヒトには投与されたことがなく、first-in-manの扱いになるため、第一日目の投与はプラセボも含め1月22日、23日、24日にそれぞれ4名、7名、8名に投与時間をずらせて行い、さらに1月29日に健康診断を実施して健康状態を確認後、全員に2月5日に2回目投与、2月19日に3回目投与、3月5日に4回目投与、そして3月19日と21日に最終の健康診断が実施された。最終的な安全性及び効果判定は現在解析中であるが、少なくとも臨床上の安全性に関しては重篤な有害事象は現在のところ認められていない。
英文要約Title:
Fundamental Translational Research for the Development of MucoRice-CTB as New Oral Vaccine for the Control of Bacterial Diarrhea.

Summary:
 
To prepare Marker free (MF)-MucoRice-CTB suitable for human vaccination trial, the selectable marker gene that confers resistance to antibiotics must be removed from the transgenic rice. With this aim, we established a technical protocol for a selectable-marker-free MucoRice-CTB (or MF-MucoRice-CTB) by co-transformation of two kinds of Agrobacterium, one carrying a selection marker (HPT gene) cassette alone and the other carrying vaccine cassette; this was followed by PCR selection for the CTB gene and self-pollination for the next generation of Mucorice-CTB. Using this protocol, we finally established MF-MucoRice-CTB, line 55A s seeds for MucoRice-CTB seed bank. Because a vaccine is a form of medical drugs, the quantity and quality of the vaccine expressed by transgenic rice should not be influenced by variations in rice-growing environments. To maintain consistent expression and quality, we established the rice hydroponics harvesting system as a bulk material GMP facility, which adopt most optimal growth-associated factors such as levels of light, water, temperature, chemicals and fertilization.
Because CTB vaccine antigen expressed in the endosperm cells of the seed’s inner layer, but not in the aleurone layer and embryo bud, we removed the aleurone layer and powdered the transgenic rice without loss of CTB, which defines as a bulk material. The shed product of MucoRice-CTB produced by adding silica and/or cellulose as inactive ingredients.We investigated the location of CTB expression and accumulation in MucoRice-CTB seeds by immune-staining and by immune-electron-microscopic analyses performed routinely in our laboratory. Further, we examined the induction of antigen-specific antibody responses and their capacity for protective immunity by oral administration of mice and rats with MucoRice-CTB. We also examined rice allergen proteins of MucoRice-CTB by comparing that of Wild type rice using 2D-DIGE and comfirmed no increase of major rice alleregens. We established specifications and test methods for the bulk substance, which contained appearance and description, identity, quantity, biological potency, and numbers of bacteria. We are conducting these test methods with collaboration of National Institute of Health Sciences. Because Mucorice-CTB is prepared as a 30ml water suspension including 1 mg of CTB, the stability at room temterarure by 6 h after preparation was confirmed. To evaluate MucoRice-CTB toxicity, we have done the saftety study using single-dose and repeated-dose oral-administration by GLP protocol in Mitsubishi Chemical Medience Co. Ltd and demonstarted no toxcity of Mucorice-CTB.
We started recurting healthy male volunteers from Dec. 3, 2012 after the approval by IRB (Institutional Review Board) of the Institute of Medical Science, the University of Tokyo (IMSUT). For volunteers, we organized the explanatory meeting for the physician-initiated POC examination of MucoRice-CTB on Jan. 7-8, 2013. We then selected subjects without CTB-specific Ab by a screening test according to the IRB approved clinical protocol and then identified 19 subjects with informed consent. A physician-initiated translation of independent single-blind research for MucoRice-CTB was done as first-in man clinical research from Jan 22, 2013 at IMSUT Hospital. Oral administration as performed 4 times at two weeks interval and fishished on Mar. 29, 2013 with final medical examination. Although analyses of clinical safety and efficacy of MucoRice-CTB have not finished yet, we found no major adverse events at learst. Overall, our project has proceeded smoothly as planned with constructive suggestions and guidance provided by basic and clinical researchers as well as regulatory scientists.
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