成果報告書詳細
管理番号20130000000551
タイトル平成20年度-平成24年度成果報告書 「創薬加速に向けたタンパク質構造解析基盤技術開発」(一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム、独立行政法人産業技術総合研究所、国立大学法人名古屋大学細胞生理学センター、国立大学法人京都大学大学院理学研究科、国立大学法人京都大学大学院農学研究科、独立行政法人理化学研究所、学校法人慶應義塾、国立大学法人東京大学大学院薬学系研究科、国立大学法人大阪大学蛋白質研究所)
公開日2014/8/8
報告書年度2008 - 2012
委託先名一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム 独立行政法人産業技術総合研究所 国立大学法人京都大学大学院理学研究科 国立大学法人京都大学大学院農学研究科 独立行政法人理化学研究所 学校法人慶應義塾 国立大学法人東京大学大学院薬学系研究科 国立大学法人大阪大学蛋白質研究所 国立大学法人名古屋大学細胞生理学センター
プロジェクト番号P08005
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約件名:平成20年度-平成24年度 創薬加速に向けたタンパク質構造解析基盤技術開発事業
 
 創薬を加速するために、電子線等による膜タンパク質及びその複合体の構造解析を行う基盤技術の開発を進めてきた。本プロジェクトでは、膜タンパク質の構造解析を進めるとともに、そのための電子顕微鏡法を中心とする技術開発や装置開発を行ってきた。以下にその成果を要約して報告する。
脳での多くの発現が確認されている水チャネルaquaporin-4:AQP4(AQP4S180D)の変異体(ドーパミンシグナルによりAQP4は水透過が制御を受けるとされているのを模倣する変異体)の2次元結晶を作製して、電子線結晶構造解析により2.8Å分解能で解析した。その密度図は、X線結晶学の1.8Å分解能の解析(J.D. Ho et al., PNAS, 106, 7437-7442 (2009))より比較にならないほど高い精度でチャネル内の水分子を分離して可視化することに成功した。また、脂質分子の構造解析にも成功した。その結果、水チャネルの速い水透過と高い選択性の分子機構を説明するH-bond isolation機構を実証することができた。AQP4は脳浮腫の原因となることが知られているので、AQP4の水透過を阻害する分子を探索し、我々はラット由来のAQP4の阻害剤(アセタゾールアミド:AZA)を同定した。AQP4とその阻害剤との複合体の構造を解析したので、その複合体の構造に基づいて、より良いAQP4阻害剤を開発している。これは、「構造に指南された創薬戦略」の典型的な例と言えるであろう。また、ギャップ結合チャネルCx26のM34A変異体の電子線結晶学による解析と野生型のX線結晶学による解析により、プラグ構造を解明し、チャネルのプラグゲーティング機構を提案した。Cx26のM34A変異体の電子線結晶学による解析の分解能を向上させることによって、Cx26のN末端の6本のへリックスが同じ深さでチャネルの中に挿入されているのではなく、上下2層になってプラグが形成されていることを解明した。無脊椎動物において、イネキシンというギャップ結合を形成する分子が、神経や筋肉のシグナル伝達において重要な役割をしていることがわかってきている。このイネキシンのギャップ結合チャネルの構造を電子線トモグラフィーで解析した。N末端を除いた変異体は逆回転してしまうことが確認できたので、このような大きなプロトン勾配に逆らってポンピングすることができるH+,K+-ATPaseの機構としてラチェットモデルを提案した。さらに胃薬候補ともなる、いくつかのH+,K+-ATPaseの阻害剤との複合体の構造も効率よく解析できるようになった。
英文要約Title: Structural Guided Drug Development (FY2008-FY2012) Report
For making drug discovery more efficient, we have made efforts to develop key technologies for structure-guided drug development. In this research projects, structure analyses of membrane proteins as well as basic technological developments on electron microscopy were achieved as following.
The structure of a mutant aquaporin-4 (AQP4S180D) mimicking phosphorylation of Ser180, which
has been implicated in the regulation of AQP4 water permeability by dopamine, was analysed at 2.8 -
resolution and the analysis enabled us to observe eight water molecules in the channel. The quality of
the map of water molecules in our analysis is far better than the map by X-ray crystallography at
higher resolution (JD Ho et al., PNAS, 106, 7437-42 (2009)). By our analysis, we could prove the
H-bond isolation mechanism, by which efficient water selective channel function was explained.
Structure analyses of water channels by electron crystallography clearly revealed structures of lipid
molecules in the 2D-crystal. We also identified a water channel blocker (AZA) of rat-AQP4. Based on
structure analysis of AQP4 combined with the inhibitor, we are trying to design new and better
inhibitor for this water channel. This could be a typical example for structure-guided drug development. We proposed plug gating mechanism based on structure analyses of gap junction channel, Cx26 by electron and X-ray crystallography. Improved map of Cx26 at higher resolution based on electron crystallography showed double layered arrangement of N-terminal helices in the plug of gap junction channel. Innexin is the molecular component of invertebrate gap junctions that have an important role in neural and muscular electrical activity in invertebrates. We analysed the junction structure by electron tomography. Cryo-electron microscopy revealed that the gap junction channel of Innexin, INX-6 is significantly larger than that of connexion. By improving computer program for electron crystallography of multilayered 2D-crystals, we could improve quality of structure analyses of AQP4, Cx26 and H+,K+-ATPase. For example, H+,K+-ATPase is an ATP-driven proton pump responsible for generating a million-fold proton gradient across the gastric membrane. From the structure of H+,K+-ATPase analysed by electron crystallography, we proposed ratchet model that the --subunit N-terminus prevents the backward reaction from E2P to E1P, which is likely to be relevant for the generation of a large H+ gradient. Several structures of H+,K+-ATPase were effectively analysed by electron crystallography at different intermediate states binding with inhibitors.
The ability of electron microscopy to form images, especially taken by originally developed cryo-electron microscope with helium cooled specimen stage, enables the acquisition of detailed structural information about membrane proteins in their physiological lipid. The ability is very powerful as a key technology for structure-guided drug development.
In this project, we have developed NMR methodologies for ligand-protein interaction study, which is required for drug development and then have applied them to several system with biological significances. We will show the two important results, as the followings.
1. Structural basis underlying the dual gate properties of KcsA: KcsA is a prokaryotic pH-dependent potassium (K) channel. We have investigated the conformational changes and equilibrium of KcsA, using NMR. Controlling the temperature and pH of KcsA samples produced three distinct methyl-TROSY and NOESY spectra, corresponding to the resting, activated, and inactivated states. K+ titration and NOE experiments revealed that the inactivated state was obtained by the replacement of K+ with H2O, which may interfere with the K+-permeation.
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