成果報告書詳細
管理番号20130000000692
タイトル平成22年度-平成24年度成果報告書 基礎研究から臨床研究への橋渡し促進技術開発 橋渡し促進技術開発 がん細胞に発現する必須アミノ酸トランスポーター(LAT1)を分子標的とする新規抗がん療法の研究開発
公開日2014/8/20
報告書年度2010 - 2012
委託先名国立大学法人群馬大学 ジェイファーマ株式会社 学校法人北里研究所北里大学病院
プロジェクト番号P07022
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約件名:平成22年度-平成24年度成果報告書 基礎研究から臨床研究への橋渡し促進技術開発 橋渡し促進技術開発 がん細胞に発現する必須アミノ酸トランスポーター(LAT1)を分子標的とする新規抗がん療法の研究開発

 以下の2大項目と5中項目の事業目標に沿って成果を要約する。
A. 診断・治療一体化戦略による抗がん療法の研究開発:診断と治療効果判定技術の確立LAT1を分子標的とした18F-FAMT PETによる診断並びに治療効果判定:
非小細胞肺がん患者のLAT1を指標としたアミノ酸(18F-FAM )PET診断は現在広く使われているグルコース(18F-FDG)PETに比してがん診断と患者の予後予測での特異性が高いことが示唆された。又、がんの化学療法あるいは化学放射線療法を行った症例の治療効果判定にも有用であることが示唆された。
免疫組織化学染色法を用いたLAT1の発現強度とがんの悪性度判定:
前立腺がん、胃がん、膵がん、肺がんの各患者から生検ないし手術により採取された組織中の免疫染色によるLAT1の発現強度と5年以内の致死性とは有意な相関が認められた。
血液を用いた新規バイオマーカーの探索:
本研究開発では健常者と癌患者血清を特別な前処理により得られたナノ粒子(exosome)中のLAT1 mRNAの定量解析を行った。非癌患者及び健常者血清と肺癌患者血清由来exosome中のLAT1 mRNAには明らかな差異が認められたので、新しいがんバイオマーカーとしての今後のJPH203の効果判定指標としての有用性が示唆された。

B. 治療薬の開発
B-1. 新規抗がん治療候補化合物(JPH203)の非臨床試験、製剤検討・製造実施
薬効薬理に関する非臨床試験:
次の各非臨床試験を実施し、臨床研究実施の裏付けデータが得られた。JPH203のLAT1選択性、各種ヒト膀胱がん、膵がん、大腸がん、胃がん由来がん細胞に対するJPH203の薬理効果、JPH203のアポトーシス誘導作用機序、LAT1ホモ遺伝子欠失マウスでの胎児致死性、30種の膜タンパク質でのJPH203の特異性を示す一般薬理試験。
JPH203の安全性試験:
ラットを用いたJPH203製剤による反復投与毒性試験、サルにおける反復投与毒性試験により臨床投与予測量十分に上回る安全性を確保できた。ラットを用いた小核試験は陰性で、心毒性のhERG試験もで陰性であった。
臨床研究用製剤の製造:
探索的臨床研究の実施を可能とするために、JPH203原薬のスケールアップ製造と、非臨床試験、臨床研究に用いるJPH203のcGMP製剤の製造を完成させた。製剤の安定性は低温保存と室温保存共に差異はなく、本研究期間内の6か月までの安定性は確立できた。

B-2. LAT1とJPH203の分子協関解明
バクテリア由来のLAT1/LAT2類似タンパク質において明らかにされた基質結合部位の情報をもとに、ヒトLAT1/LAT2の基質結合部位のシミュレーション解析を行った。正常細胞型アミノ酸トランスポーターであるLAT2の構造モデルを構築し、LAT1のモデルと比較したところ、基質結合部位周辺の構造に明らかな違いが見られた。そこで、LAT1およびLAT2モデルそれぞれに対してJPH203との結合シミュレーションを行った結果、LAT1とJPH203の結合は、バクテリア類似タンパク質で見られている基質結合様式に相当するものが推測されたが、JPH203のLAT2への結合は基質結合部位には見られなかった。このことから、JPH203のLAT1への選択性の高さが、構造モデルにおいても明らかとなった。

B-3. マイクロドーズ試験の研究
マイクロドーズ臨床試験(MD)の実施に先立ち、JPH203のラットでのin vivo体内動態解析を行った。JPH203はN-acetyl化とそれに引き続いて生じる胆管側の排出が、生体内からの主要な排泄経路であることを明らかにした。JPH203およびそのN-acetyl体はOATP1B1、OATP1B3の基質となること、JPH203はさらにOATP2B1の基質ともなることを見出した。JPH203はラットでは肝血流律速であるのに対して、ヒトでは血流速度に比べて十分小さく、血液への滞留性が高い事が示唆された。さらに、OATP1B1に対するJPH203のKm値は、LAT1に対するIC50値の約40倍乖離しているものの、LAT1機能を強く阻害する濃度では、OATP1B1による肝取り込みが飽和し、血中動態が非線形性(滞留性の延長)を示す可能性が示唆された。MDはcGMP製剤製造の関係で実施が見送られた。
英文要約Title: Anti-cancer translational research and development: Targeting cancer-expressing essential amino acid transporter LAT1 (FY2010-FY2012) Final Report

The overall project results are summarized into two sections “A” and “B” and section B has been broken up into five sub-sets denoted as B1-B5.

A.Anti-cancer therapy and diagnosis:
Using a Positron Emission Tomography (PET) molecule, we have confirmed that 18F-FAMT is selectively accumulated into LAT1 expressing cells (cancer type) while it does not really accumulate into LAT2 expressing cells (normal type). 18F-FAMT is better than the conventional glucose PET probe, 18F-FDG; 18F-FAMT has been shown to be a more robust predictor of five year longevity in non-small cell carcinoma. Therefore, 18F-FAMT is not only applicable for use to diagnosis cancer, but it may be used to monitor anticancer drug effectiveness as well.

Immuno-histo-chemical analysis using an anti-LAT1 antibody for evaluation of cancer malignancy has established significant correlations between LAT1 expression and five year longevity via biopsy specimens or surgically removed tissues from prostate, gastric, pancreatic and lung cancer patients.

Novel biomarker using blood samples - Using specially prepared blood samples, LAT1 mRNA quantification methods may be used to monitor patient cancer status and evaluate drug therapy effectiveness.

B.Therapeutic agent development:

B-1.Pre-clinical studies and formulation optimization
Fundamental Preclinical and secondary pharmacology studies
The following have been established regarding JPH203: JPH203 has been demonstrated to be a potent and LAT1 selectivity inhibitor and effective both in vitro and in vivo. The therapeutic effectiveness was established: i) using human cancer-derived cell lines from urinary bladder, pancreas, colon, stomach and prostate; ii) embryo lethality of LAT1-mono knock-out mice; iii) an apoptosis induction mechanism via JPH203; and iv) specificity of JPH203 as the LAT1 inhibitor comparing with 30 other membrane proteins (i.e. 2ndary pharmacology screening).

Safety pharmacology and toxicology
GLP studies were completed to probe safety with in rats via a 4-week repeat iv administration (3 doses). Monkey non-GLP experiments for 1 week to confirm drug safety. In addition, micro nuclear test with rats and in vitro hERG experiments were negative.

CMC: API scale-up production and cGMP formulation
To ascertain clinical investigation, bulk JPH203 (API) synthesis was required and established; we can product Kg quantity API production. Suitable formulation was also established and its cGMP production was completed. Formulation stability (six-month) was confirmed under both low and high temperatures, and continued long term stability testing is on-going.

B-2.Molecular inter-relationship between LAT1 and JPH203
Using information obtained from the crystal structure of bacterial transporters, simulation analysis was performed to probe suitable relationship between LAT1 protein and JPH203. Compared to LAT2/JPH203, a sound molecular fit displaying LAT1/JPH203 was ascertained (unpublished data; Figure 2). Thus, functional specificity of JPH203 with LAT1 was confirmed by structure model analysis.

B-3.Micro dose (MD) test
Prior to MD test, pharmacokinetic analyses were carried out in vitro and in vivo. In rats, JPH203 was metabolized to N-actyl-JPH203 (NAc-JPH203), and the metabolite was eliminated into bile (Wempe et al., 2012; Toyoshima et al., 2013). Both JPH203 and NAc-JPH203 are substrates for OATP1B1 and OATP1B3, and JPH203 is an OATP2B1 substrate. Although the metabolism was hepatic blood flow-dependent in rats, in the data suggests that it will be different in human.
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