成果報告書詳細
管理番号20130000000855
タイトル平成21年度-平成24年度成果報告書 新エネルギー技術研究開発 バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発 (先導技術開発) 糖化酵素を高度に蓄積するバイオ燃料用草本植物の開発
公開日2014/8/27
報告書年度2009 - 2012
委託先名株式会社ホンダ・リサーチ・インスティチュート・ジャパン 国立大学法人京都大学
プロジェクト番号P07015
部署名新エネルギー部
和文要約糖やデンプンを原料としたバイオ燃料は実用化の段階に入っているが、食糧との競合という問題を抱えている。一方、セルロース系バイオマスを原料としたバイオ燃料は、化石燃料に比べ製造コストが高く、普及のネックとなっている。本研究は、セルロース系バイオ燃料のコスト要因である糖化酵素を安価に植物で生産する『自己消化型バイオマス植物』の実現を目指している。植物体セルロースの完全糖化が可能な量である、バイオマス乾物重比1%(全可溶性タンパク質比6.5%相当)の糖化酵素蓄積を目標として、糖化酵素を蓄積する細胞内小器官の異種形成技術、これら器官による糖化酵素蓄積技術、及び酵素生産ホストとしてのスイッチグラス形質転換技術の開発を行なった。

1)小胞体に糖化酵素を高度に蓄積するバイオ燃料用草本植物の開発
細胞内小器官一つ、小胞体は植物の種子や茎葉においてタンパク質を高濃度で蓄積することが知られている。小胞体由来の蓄積器官=ERボディを異種植物に形成させ、糖化酵素を蓄積させる遺伝子組換え技術の開発を行った。糖化酵素蓄積量と酵素活性を評価するため、組換え酵母を用いて標準糖化酵素を得た。バイオ燃料用草本植物に適した形質転換用ベクターを構築し、蓄積器官形成関連因子と糖化酵素/蛍光タンパク質遺伝子を適宜組み合わせた植物発現用ベクターを構築した。アグロバクテリウム法による形質転換を行い、イネで500系統以上、スイッチグラスで200系統以上の形質転換植物を得た。種々の評価から、イネでは蓄積器官の形成と糖化酵素の蓄積量増加が確認された。一方、スイッチグラスでは蓄積器官が形成されたものの糖化酵素蓄積は僅かに観察されるのみであった。

2)液胞に糖化酵素を高度に蓄積するバイオ燃料用草本植物の開発
液胞は植物細胞中で最大容量を占める細胞内小器官であるが、多量のタンパク質分解酵素を含み、糖化酵素を蓄積させることは難しい。そこで、高濃度のタンパク質が液胞に蓄積する特殊な細胞=ミロシン細胞を異種植物に形成させ、糖化酵素を蓄積させる技術の開発を試みた。機能欠損・過剰発現変異体解析により、シロイヌナズナからミロシン細胞形成誘導因子を単離・同定し、イネから相同遺伝子を単離・同定することに成功した。シロイヌナズナ形質転換体の解析により、ミロシン細胞が活性型糖化酵素を高濃度で蓄積することを明らかにした。ミロシン細胞形成関連因子及び糖化酵素遺伝子を種々のプロモーターに連結した植物発現ベクターを構築し、120系統以上のスイッチグラス形質転換体を作出した。傷害誘導発現型プロモーターと連結したミロシン細胞形成関連因子を導入したスイッチグラス形質転換体では、目標値を上回る全可溶性タンパク質比7.7%の糖化酵素蓄積に成功した。

3)スイッチグラス形質転換系の開発
スイッチグラスは有望なイネ科バイオ燃料用草本植物の一つであるが、形質転換系は低効率であり、かつ複雑な形質転換操作が必要とされる。より簡便で安定高効率な形質転換技術の開発を行った。完熟種子から500系統以上のカルスを誘導し、高い再分化能をもつ優良系統を20系統以上選抜し、アグロバクテリウム法による形質転換効率が最高60%に達する技術の開発に成功した。これにより、代表的なlowland品種‘Alamo’ だけでなく、‘Kanlow’さらにはupland品種‘Trailblazer’の形質転換も可能となった。これら優良カルス系統の安定的長期保存が可能な超低温保存法及び形質転換体の大量増殖を可能とする節培養法を確立した。
英文要約Summary
The objective of this research is to facilitate the storage of cellulolytic enzymes in subcellular organelles of herbaceous biofuel feedstocks and to enable a simultaneous supply of cellulosic biomass and cellulolytic enzymes. Our goal is to produce modified switchgrass that stores 1% of its dry weight (= 6.5% of the total soluble protein) in cellulolytic enzymes, thereby enabling all of the cellulose in the plant to be saccharified.
(1) Storage in Endoplasmic Reticulum. Expression cassettes that contained the cellulolytic enzyme/green fluorescent protein (GFP) gene and genetic elements related to endoplasmic reticulum (ER) storage were constructed, introduced into binary vectors and then used for Agrobacterium-mediated transformation of plants. Introduction of these expression constructs generated more than 500 and 200 transgenic rice and switchgrass plants, respectively. We confirmed the formation of novel ER-derived storage organelles and improvement of cellulolytic enzyme accumulation. Formation of novel ER-derived storage organelles was also confirmed in GFP-expressed transgenic switchgrass plants. However, high level accumulation of cellulolytic enzyme was not observed in enzyme-expressing switchgrass plants, probably due to suppression of transcription and/or translation.
(2) Storage in Vacuole. We isolated vacuole storage-related genetic elements from wild-type Arabidopsis and rice. The expression cassettes contain both the genes encoding the cellulolytic enzyme/GFP and an inducible promoter-driven vacuole storage-related genetic element. These expression cassettes were introduced into binary vectors and then used for Agrobacterium-mediated transformation of switchgrass. More than 120 transgenic switchgrass plants introduced with these expression constructs were obtained. Both fluorescence microscopic and immunoblot analyses confirmed that the accumulation level of the fluorescent protein/cellulolytic enzyme in transgenic switchgrass increased several fold after the induction treatment. In two transgenic switchgrass lines, cellulolytic enzyme was accumulated at up to 7.7% of the total soluble protein. The accumulated cellulolytic enzymes were stable in plant tissues for at least a week after harvest and induction treatment at room temperature.
(3) Genetic Modification of Switchgrass. Elite embryogenic callus lines showing high regeneration capacity were induced from caryopses of two lowland cultivars and three upland cultivars. A simple and efficient Agrobacterium-mediated transformation method was successfully established by optimizing various transformation stages. Using the established method, transformation efficiency was achieved at up to 60% for upland ‘Alamo’ strain, while transgenic plants of upland ‘Trailblazer’ strain were first established in this study. Stable long-term storage of embryogenic calli by cryopreservation and micropropagation of transgenic plants via nodal culture were also established.
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