タイトル平成24年度-平成25年度成果報告書 「環境・医療分野の国際研究開発・実証プロジェクト フランスにおける国際共同研究開発・実証事業 OnーDemand Multi-mixed Protein Quantification Kitの技術開発」(株式会社Proteomedix Frontiers、国立大学法人東北大学)
報告書年度2012 - 2013
委託先名株式会社Proteomedix Frontiers 国立大学法人東北大学
和文要約平成24年度-平成25年度成果報告書 環境・医療分野の国際研究開発・実証プロジェクト/フランスにおける国際共同研究開発・実証事業「On-Demand Multi-mixed Protein Quantification Kitの技術開発」

本研究開発では、新薬開発や病態診断など医薬関連産業における多様でグローバルなニーズに迅速に応える「高速液体クロマトグラフィー-質量分析装置(LC-MS/MS)を用いたオン・デマンド型タンパク質絶対定量の第二世代型キット」を、フランス参画企業との共同で開発することを目的とした。特に、キットの根幹をなす50種類程度のタンパク質に対する定量標的ペプチドをタンデムに並べた人工内標準タンパク質の設計と高効率合成のための要素技術開発を中心的課題とした。具体的には、定量標的ペプチド配列のin silico選択に基づくタンパク質の配列設計と、高収率合成のための設計クライテリアの構築、及び合成・精製プロトコールの最適化及びLC溶出時間の予測評価に加え、オン・デマンドに対応する質量分析条件最適化法を構築した。特に、人工内標準タンパク質のアミノ酸組成とペプチドの配列順序が、合成収率に影響することを見出し、高い合成収率が予測される配列設計と精製の難易度を下げるためのクライテリア構築を進めた。さらに、高頻度でおこる人工内標準タンパク質の難溶化・不溶化について、界面活性剤及び還元剤を含む可溶化条件でタンパク質を完全に溶解後、1段階目にN末端側の精製用タグで目的のタンパク質を粗精製し、溶媒置換をすることなく、2段階目にC末端側の精製タグでさらに精製を行う方法を確立した。従来法では、絶対定量に必要な安定同位元素標識内標準ペプチドと、検量線の作製のための天然型ペプチドを化学合成する必要があった。また、多数のタンパク質の定量には、莫大な費用と個別にペプチド濃度を決定するための操作の煩雑さ及びそれに要する時間のために、実用化の障害になっていた。多種類の内標準ペプチドを一度に合成する技術を開発したことで、大幅なコスト削減と混合溶液調整操作の簡便化・迅速化を実現した。さらに、実用化を視野に入れて、主に創薬研究領域に焦点を当て、タンパク質定量キットの需要が見込まれる対象領域を調査した。その結果対象を、探索研究における創薬標的タンパク質の絞り込み、薬物動態試験における、薬物の体内分布解析、臨床試験における、層別化・個別化のための分子標的薬の標的となる受容体等の定量解析とした。本研究開発では、薬物トランスポーターや代謝酵素などの薬物動態を規定するタンパク質定量用の人工内標準を5種類、及び抗がん剤分子標的関連のタンパク質群(受容体、シグナル伝達経路、リガンド)の定量用の人工内標準タンパク質を5種類について、配列設計法及びタンパク質精製の改良法に基づいて合成精製に成功し、一斉質量分析を実現した。キット製品化に必須の技術的課題を解決するため、大量合成した際の不溶化・難溶化タンパク質の精製法、内標準タンパク質保存安定化法、トリプシン消化効率を含むサンプル前処理操作に優れたモニタリング効果を示すMonitoring proteinの開発、内標準の定量精度向上のためのアミノ酸分析法の改良を行った。定量キット化の最終段階として、作製した内標準タンパク質を、フランス参画企業Bertin Pharmaに送付し、キット性能のバリデーションを実施した。日本側が開発した要素技術とフランス側の得意分野であるキット製品化のノウハウによって、オン・デマンド型Multi-mixedタンパク質定量キット研究開発を実現した。
英文要約Title: Japan-France collaborative industrial R&D demonstration programme. Technology development of an On-demand Multi-mixed Protein Quantification Kit (FY2012-FY2013) Final Report

The purpose of this project is to develop an “On-demand multi-mixed simultaneous and mass-scale protein quantification kit” based on a combination of molecular biology and quantitative targeted absolute proteomics technologies. This project produced the stable isotope-labeled artificial protein containing internal standard peptides in tandem to overcome the limitation of chemically synthetic peptides. In the first step, we selected the trypsin-digested sequences of target peptides to be quantified by using our patented in silico peptide selection criteria. In the second step, we designed and synthesized cDNA construct of a series of internal standard peptides in tandem, in which two types of absolute quantification tag peptides and purification tag peptides were added at amino- and carboxyl-terminus. In the third step, we produced the stable-isotope labeled internal standard protein by using in vitro cell free system and/or E. coli system. In this step, the yield, purity, stable-isotope labeling efficacy, and stability of the synthesized protein are critical subjects for the kit commercialization. We found that yield of protein synthesis by the cell free system depends on the physicochemical characteristics of the protein and made a new criterion of the protein amino acid sequence for high-efficacy synthesis. In order to obtain a full-length protein with high purity, we have established the sequential two-step purification with both N- and C-terminus tags and two types of the corresponding affinity columns. Because the proteins were produced frequently as insoluble protein aggregates, the composition of solubilizing buffer containing a detergent and a reducing agent was optimized. We further optimized the methods for the protein stabilization, amino acid analysis with higher efficacy and accuracy. In the fourth step, we established the method to optimize the LC-MS/MS analyzing conditions simultaneously for each peptide after trypsin digestion. The concentrated elution of many peptides at similar retention times and the too early and too late elution may cause the lower peptide detection sensitivity. This could be prevented by arranging the peptide elution based on the prediction of LC-elution time. In the fifth step, we investigated the demands of the quantification kits in the fields of drug development and determined the lineup of the kits which are targeted at the preclinical and clinical stages. We succeeded to produce ten kinds of the internal standard proteins for the simultaneous quantification of drug transporters, drug metabolizing enzymes, cancer molecular targeted drugs-targeting proteins such as growth factor receptors, those ligands, and signaling cascades. In the final step, the optimized protocol proceeded to make a cross-validation of the kit. The Japanese-French collaboration project has made it possible to develop the second generation-kit allowing on-demand simultaneous and mass-scale protein quantification.