成果報告書詳細
管理番号20140000000263
タイトル平成24年度-平成25年度成果報告書 「環境・医療分野の国際研究開発・実証プロジェクト フランスにおける国際共同研究開発・実証事業 急性期バイオマーカーのPoint Of Care Testing(POCT)の開発」(株式会社シノテスト)
公開日2014/8/8
報告書年度2012 - 2013
委託先名株式会社シノテスト
プロジェクト番号P11017
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約要約HMGB1(High Mobility Group Box 1)は、敗血症を初め、さまざまな急性炎症疾患の重症度の指標、治療標的として注目されるバイオマーカーである。現在、(株)シノテストから研究用試薬としてHMGB1 を測定するELISA キットが販売されており、HMGB1 研究者の間ではゴールドスタンダードとして使われているが、測定に22 時間かかることから、将来の臨床応用の重要分野である急性疾患の診断には不向きである。
そのため、迅速で、且つ簡便なHMGB1 の測定方法の開発が望まれる。本プロジェク
トでは、(株)シノテストの抗体技術とMagnisense SE 社の微量磁性化粒子の高感度検出技術(MIAtek)を組み合わせ、現在のHMGB1 測定キットと同等かそれ以上の感度、特異性を持ち、1 時間以内の測定が可能な測定法の開発を目指した。
初めに、条件の絞り込みに際して、幅広い条件の検討が容易なMIAflo 方式で、HMGB1 測定が可能となる基本となる条件の検討を行なった。MIAflo は、ピペットチップ内に設置した多孔質フィルターを固相とし、1 次抗体を吸着させるものである。その結果、シノテストから供給した2 種類の抗体ペアのうちCombo B で再現性のある測定が可能となり、また多孔質フィルターへの固相化(感作)には、Magnisense SE 社の吸着緩衝液1 を用いたときに、より高感度で磁気シグナルが得られることが分かった。その結果を踏まえ、臨床現場での利用により適しているMIAstrip 方式で、水溶液サンプルの定量性、再現性の確認を行い、その後、プール血清にHMGB1 を添加したサンプル(擬似的な検体)によって定量性、再現性の確認を行なった。水溶液サンプル、血清サンプルの両者において、0 から80 ng/mL の間で良好な定量性、再現性が得られたものの、20 ng/mL を超える濃度域ではシグナルの直線性が失われた。検出の下限は、目標である現行のELISA法の1 ng/mLに近い、1.6 ng/mLであった。また、MIAstrip カートリッジ中の磁性粒子の分布を測定すると、サンプルを添加する吸収体と展開メンブレンの接合部に多くの磁性粒子が滞留していることが分かった。これは、抗体を感作させた磁性粒子が、血清中で凝集していることに起因しているものと思われた。上述の凝集の抑制、その他、感度、ダイナミックレンジの向上、直線性、検出限界の改善が課題として残るものの、有望な技術であることが確認された。
英文要約HMGB1 (High Mobility Group Box 1) is a biomarkers which could be used as an
indicator of severity of acute phase diseases including sepsis, as well as a direct
therapeutic target. Currently a ELISA kit for HMGB1 for research use is commercially
available from Shino-Test Corporation. Although the assay is considered to be the gold
standard amongst HMGB1 researchers, it takes 22 hours minimum to obtain the result,
and this makes the product unsuitable for the use in the clinical setting, i.e., diagnosis of
acute phase diseases. Rapid and easy-to-use assay for HMGB1 is thus strongly desired.
This project aimed at developing an assay that enables one to obtain results in less than
one hour with the sensitivity and specificity at an equal or surpassing level to the current
ELISA assay, by combining Shino-Test’s proprietary antibodies and Magnisense’s high
sensitive magnetization detection method (MIAtek).
To begin, we chose MIAflo format, which is suitable for searching a wide range of
experimental conditions, to narrow down fundamental requirements for HMGB1
detection. MIAflo uses porous filter inserted in pipette tips as the solid phase on which
the capture antibody is adsorbed. From this part of the study, we found that Combo B,
one of the two antibody pairs of Shino-Test, could reproducibly measure HMGB1. It
was also found that Adsorption Buffer 1 of Magnisense was best suited to obtain
magnetic signals at high sensitivities.
Next, we tested MIAstrip, which is more suitable than MIAflow in the clinical settings.
Aqueous samples were measured to assess the assay’s quantitative performance and
reproducibility. The same were done for pooled serum spiked with purified HMGB1. In
both sets of samples, HMGB1 concentrations from 0 to 80 ng/mL could be quantified
with good reproducibility. However, the linearity was lost above 20 ng/mL in both cases.
The lower limit of detection (LOD) was 1.6 ng/mL which is close to 1 ng/mL, the
LOD of the current ELISA. The magnetic beads were geometrically scanned throughout
the MIAstrip cartridge and a significant portion of them were found accumulated at the
interface of the absorbent and the nitrocellulose membrane. Aggregation of the antibody
conjugated magnetic beads in serum.
Although the aggregation mentioned above, and other technical issues such as the
sensitivity, dynamic range, linearity and LOD need to be improved, the assay developed
here was proved to be promising for future clinical applications.
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