成果報告書詳細
管理番号20140000000264
タイトル平成24年度-平成25年度成果報告書 「環境・医療分野の国際研究開発・実証プロジェクト フランスにおける国際共同研究開発・実証事業 ヒト化動物を用いた次世代型がん領域創薬支援システムの研究開発・実証」(インビボサイエンス株式会社)
公開日2014/8/8
報告書年度2012 - 2013
委託先名インビボサイエンス株式会社
プロジェクト番号P11017
部署名バイオテクノロジー・医療技術部
和文要約 本事業は、NEDOと仏国OSEOが協同して、日仏企業等が技術開発、イノベーションで戦略的重要性のある分野で連携しそれを基盤とした事業化を促進するプロジェクトである。日本側は公益財団法人実験動物中央研究所および弊社、仏国側はオンコデザイン社が担当し、より効率的な抗がん剤の開発を支援する創薬ツールとして、患者やがんの相互作用をマウスの中で再現する「次世代型のヒト化マウス」を開発し、実証研究を経て受託試験システムの開発を行なった。設定した研究開発項目毎に結果の要約を記す。
研究開発項目・ 次世代ヒト化マウス用NOGマウスの実験動物化
 実中研により実施された。次世代型改良NOGマウスとして、TK-NOG、NOG-IL-2、NOG-IL-15およびNOG-HLA/DdA2マウスの系統化が行なわれた。当社は実中研の指導を受け、下記研究開発項目・に供した。
研究開発項目・「ヒト化マウスモデルの確立」
 実中研により実施された。NOG-hIL-2および NOG-hIL-15マウスにヒト造血幹細胞が移植されADCC活性がされた。当社はその成果をふまえ、研究開発項目・を実施するために国際共同研究の橋渡し、調整を行なった。
研究開発項目・「効率的生産方法の開発および、そのための遺伝子解析」
 実中研が先のモデル動物開発時に検討した遺伝子解析法を導入し、再現性、効率性の観点でプロトコールを編集し、改良検査方法による検査データを積み上げ、製品生産段階での検査方法を検討した。とくに、核酸抽出過程を省略したPCR検査法での遺伝子検査の判定効率(疑陽性の出現レベル等)を検討した。遺伝子検査として、TK-NOGマウス4884匹、NOG-hIL-2マウス412匹を行った。また、各種核酸重合酵素の各検査方法との相性、低価格製品の品質を検討した。その結果、SDSを不含溶解バッファーによるマウステールの溶解、その溶解液を直接鋳型とした real-time PCR を出荷検査法として確立した。PCR のコントロールとしてTK-NOGマウスではGapdh 遺伝子、NOG-hIL-2マウスではb-actin 遺伝子に対するプライマーを用いた。また、NOG-HLA/DdA2については、実中研の指導のもとファックス解析方法の製品検査法レベルでのプロトコールを検討し、抗ヒトHLA-A2抗体と抗ヒトH2Kd 抗体を用いたフローサイトメーター検査方法を確立し、表現型検査として276匹の解析を行った。
研究開発項目・ 「臨床材料を用いた実証研究」
 フランスの共同研究先であるオンコデザイン社が実施する実験計画の確定のため、電話会議および現地での打合せ(H24.11.25、H25.10.27)を含みオ社との調整を実施した。とくにTK-NOGマウスにおけるヒト肝臓の再構成については、初期段階でオ社の再現性とキメラ効率が低く、技術レベルの調整を行なった。最終的に、GCV投与プロトコールと投与量の変更により当地での試験が可能であることが確認された。なお、フランスでは臨床材料の入手にアドバンスがあり、今般の国際共同研究においてもその点が実証研究に役立った。例えば、当地では非凍結の造血幹細胞の移植も可能であり、実中研のような長年の経験のない段階で高率のヒト造血系再構成マウスが得られ、ADCC等の検討に供することができた。なお、この成果は国際共同研究として、ボストンで開催されたEORTC/AACR/NCI共催の国際学会で発表した。
英文要約This project was held as an international collaboration between NEDO, Japan, and OSEO, France. The purpose of the project was to proceed generation of new businesses based on cutting edge and innovative techniques in participants. The participants of the project were Public Interest Incorporated Foundation Central Institute for Experimental Animals (CIEA) and In-Vivo Science Inc.(IVS) in Japan and Oncodesign Biotechnology (ODS) in France. All parties aimed to develop humanized mice that can be contributed to new drug discovery in cancer, efficiently. We call the mice as “next generation humanized mice”. It is possible to reproduce human tumor in the next generation humanized mice. Thanks to the grant support, we have been able to establish systems to provide those services to customers. Each results are shown below;

Aim 1. Establishing experimental animal lines
Four mouse lines, TK-NOG、NOG-IL-2、NOG-IL-15 and NOG-HLA/DdA2, have been established by CIEA for the project. According to CIEA supervising, the IVS used them for the research aim 3 as described below.

Aim 2. Developing humanized mouse models
Human hematopoietic stem cell (HSC) transplanted NOG-hIL-2 and NOG-hIL-15 were prepared by CIEA. Their ADCC activities were also evaluated by CIEA. Based on these results, IVS arranged the international collaboration described below.

Aim 3. Establsihing efficient production system and genotyping method
IVS improved the genotyping method developed by CIEA. Improved genotyping method is able to show high reproducibility as well as high efficacy. Using the method, IVS conducted a lot of tests to make it for business level. The method can reduce a step that is nucleic acid extraction process for PCR analysis. Practically, IVS performed genotyping tests of TK-NOG (4,884 heads) and NOG-hIL-2 (412 heads). In addition, IVS evaluated the polymerases and others to establish the analysis method, including cost reduction. As a result of above evaluations, IVS decided that mouse tail is treated in dissolution buffer (w/o SDS) and, then, applied to real-time PCR analysis. As a positive controls, Gapdh gene for TK-NOG mouse and b-actin for NOG-hIL-2 mouse were employed. Regarding NOG-HLA/DdA2 mouse, FACS analysis using anti-human HLA-A2 antibody and anti-human H2Kd antibody was performed. Two hundreds sixty seven heads of NOG-HLA/DdA2 mice were analyzed with the method.

Aim 4. Research & Development with clinical materials
IVS played a role to arrange study protocol with ODS. IVS and ODS held several phone conferences and, actually, visited at ODS twice (25 November 2012 and 27 October 2013). Especially, chimeric ratio of human liver transplantation to TK-NOG mouse was not sufficient at ODS study. IVS supported to tech transfer from CIEA to ODS. Finally it was revealed that GCV injection was not optimized at ODS. It is apparent that we can use much more clinical materials in France rather than Japan. For instance, it is possible to acquire fresh (unfreeze) human hematopoietic stem cell (HSC). Based on the condition, ODS could achieved to acquire high chimeric ratio of human HSC transplanted NOG mouse. And ODS performed an ADCC test with those mice. These results were reported at EORTC/AACR/NCI in Boston.
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