成果報告書詳細
管理番号20140000000279
タイトル平成24年度-平成25年度成果報告書 バイオマスエネルギー技術研究開発 戦略的次世代バイオマスエネルギー利用技術開発事業 (次世代技術開発) 微細藻類バイオ燃料製造に関する実用化技術強化の研究開発
公開日2014/8/23
報告書年度2012 - 2013
委託先名JX日鉱石エネルギー株式会社 ヤンマー株式会社 独立行政法人製品評価技術基盤機構 学校法人近畿大学 国立大学法人京都大学
プロジェクト番号P10010
部署名新エネルギー部
和文要約微細藻によるバイオ燃料製造の課題を解決するために、油脂生産性微細藻の一次スクリーニングのための総合的な評価方法の構築、屋外での培養に適した微細藻の評価方法の構築、将来に資する遺伝子組換えによる改良と生物学的封じ込めの可能性の検討、および微細藻の安全・安価な保存法の検討、を実施した。バイオ燃料原料に適した微細藻類株のスクリーニング方法の構築のために、NITEが保有する油脂産生藻類を対象に培養調査及び炭化水素や脂肪酸の分析を実施し、評価系構築のためのデータマトリックスを作成した。各種要件の優位性から有用油脂産生候補株を見いだし、細胞の硬さや下記の屋外模擬培養試験結果をフィードバックすることにより、評価系構築に必須なキーキャラクターの創出を試みた。同時に、候補株の油脂生産性に関しての検討も実施し、日産9 g/m2を超える株の存在が確認出来た。屋外培養に適した微細藻類の選択のための評価系の構築を目標に、酸素濃度計およびクロロフィル蛍光画像を用いて、複数の株を同じ環境条件で同時に計測できるシステムの開発を行った。溶存酸素濃度から酸素発生量、消費量を株ごとに計測することが可能となり、蛍光パラメータにより株を類型化できることが示唆された。さらに、側面から撮像した蛍光画像から、希釈により強光条件下と同様の反応が見られたため、培養初期の低濃度状態では、強光障害が生じている可能性が考えられた。このことを定量的に分析し、光強度に対する最適な微細藻濃度管理や撹拌性能を明らかにするために、層別水槽の設計を行った。将来的には遺伝子組換えによるポテンシャルの向上は必要なものとなると考え、遺伝子組換えによる性能改善の検討(組換え法の確立、生物学的封じ込め技術の探索)を実施した。NITEの油脂生産候補株に対して、形質転換体の選抜に用いる抗生物質の種類および至適濃度の検討を行った結果、10〜150 mg/Lのパロモマイシンが選抜には最適であることがわかった。次に、増殖特性及び脂質産生能力が良好な2株(Kama-04、MzTnk)に対して、パーティクルガン法およびエレクトロポレーション法により複数の薬剤耐性株が得られ、ゲノミックPCRによる遺伝子導入確認が可能な導入条件をそれぞれ把握した。さらにGFP遺伝子の導入により、遺伝子導入株でGFP蛍光が観察された。一方、上記2株から、葉緑体ゲノムにコードされているrbcL遺伝子およびその上流配列を単離し、葉緑体形質転換用ベクターを構築した。クラミドモナスを用いて、CO2要求性とオートファジーに関して「生物学的封じ込め技術」への利用の可能性を検討した。CO2濃度が5%では生育できるが、0.04%では生育が遅延する高CO2要求性形質を示すクラミドモナス変異株を遺伝子タギングによりスクリーニングし、6株の高CO2要求性変異株を単離した。これらの株ではCO2ガス交換活性とともに無機炭素への親和性が大きく減少していた。H82と名づけた株では無機炭素輸送体であるHLA3とLCIAの蓄積が損なわれていた。低栄養の培養系外環境中では生育が抑制される株の作出に、オートファジーの機能欠損を利用することを目標として、オートファジー関連遺伝子の挿入変異株をスクリーニングし5株の変異体を得た。このうち2株では窒素欠乏条件下のクロロフィル分解が野生型よりも亢進し、コロニー形成能が低下していた。安定かつ安価な保存方法に関しては、コンベンショナルな凍結保存法が概ね導入可能である結果を得た。
英文要約In order to solve the problems on microalgae fuel production, primary screening methods for oil producible strain, evaluation methods for strain suitable for outdoor cultures, r-DNA method for improvement of strain, and a safe and low cost preservation method were investigated in this project. We checked the growth performance, lipid profiles, and cellular consistency for lipid producing microalgae, and constructed the data matrix sets. We will feedback these result to the current data matrix sets, and find out the key character for the evaluation system of lipids producing strains. We examined the lipids productivity and 2 strains showed over than 9 g/m2/day (= targeted value) lipid productivity. For establishment of evaluation methods for strains suitable for outdoor culture, DO (dissolved oxygen) sensor was installed into photo-bio-reactor and it was observed that differences in chlorophyll fluorescence (CF) parameters of five strains under some light conditions, which implied that the CF can classify strains according to their responses to light intensity and variation. However, clear relationship was not observed between O2 generation and CF parameters, because of insufficient sample number, therefore we should develop high-speed analysis system. As a low density culture lead to photo-inhibition, we developed a special photo-bio-reactor divided into 5 rooms, which can be used to reveal suitable environment control and stiring ability. In order to estimate r-DNA method for improvement of strain, we determined the resistance towards antibiotics of oil-producing strains, and found that all transformed cells are screened by paromomycin (10-150 mg/L). We analyzed the experimental conditions of transformation to obtain a number of antibiotic-resistant Kama-04 and MzTnk cells. We detected the genes introduced in a lot of transformants by a genomic PCR, and observed GFP fluorescence in gfp-introducing transformants. For the construction of vector for chloroplast transformation, we isolated rbcL gene from Kama-04 and MzTnk cells. It is important to keep the genetically modified organisms (GMO) in restricted culture area not to spread out to nature. We tried to establish technologies using Chlamydomonas, which support biological isolation of the GMO from nature. We isolated 6 HC-requiring mutants defective in carbon-concentrating mechanism. The photosynthetic CO2-exchange activities and affinity for Ci of these mutants were significantly decreased compared with wild-type. Accumulation of inorganic transporters, HLA3 and LCIA, were absent in the mutant H82. To evaluate the use of autophagy-defective mutants for biological containment of transgenic strains, 5 insertion mutants of autophagy-related genes were screened. Under nitrogen starvation, 2 of them showed enhanced chlorophyll-degradation and lower colony-forming activity compared with wild-type. For the long-term preservation, conventional cryopreservation method can apply for these algae.
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